论文摘要
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）主要定植于人胃粘膜上皮细胞,是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素,与胃癌及胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤发生密切相关,1994年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）已将其列为Ⅰ类致癌因子。流行病学调查显示,粪—口途径是幽门螺杆菌的重要传播途径之一,该菌在体内存活及体外传播过程中必然会遭受到多种环境压力的胁迫,细菌通过启动一系列的适应性调节机制来抵抗这些胁迫因素以达到保种生存并导致疾病的目的。幽门螺杆菌的一个显著特征就是能够在人胃的极端酸性环境中生存,人胃腔内的pH值在饥饿时可低达1.0,在自酸性的胃腔向胃粘膜层移动过程中,幽门螺杆菌不可避免的应对pH值的不断波动。现今研究较清楚的幽门螺杆菌抗酸机制就是其脲素酶系统,脲素酶可分解脲素产生氨和二氧化碳来提高细菌微环境的pH值,然而,胃液内的脲素浓度往往约为1mM,仅通过该系统不能完全保证幽门螺杆菌在酸性胃环境的存活。因此,推测在幽门螺杆菌的酸性应答过程中还存在其它的pH平衡系统。餐后胆汁返流入胃是一种正常的生理现象,患有胃肠道疾病者此现象更为严重;许多研究证明粪-口途径是幽门螺杆菌进入人体消化道的一种重要途径,那么在其传播过程中,幽门螺杆菌必定经过富含胆汁的肠道,耐受并抵抗胆汁对它的胁迫作用;另外,人们利用聚合酶链反应和DNA印迹等方法在胆汁,胆囊和肝组织中检测到幽门螺杆菌的存在。以上均说明幽门螺杆菌对胆汁的耐受性是其在人类胃肠道定植和生存重要机制,幽门螺杆菌通过何种机制在富含胆汁的环境中生存还不清楚。形态学改变是细菌抗逆生存的重要调节机制之一,在O2压力,低pH值等不利的培养条件下或抗菌治疗后,幽门螺杆菌可转变为活的非可培养状态的球形体,这种形态学转变是一种积极的生物学应答过程,是幽门螺杆菌的一种保护性抗逆生存机制。当细菌受到胁迫时也可进入非分裂状态,这在医学研究上具有重要意义。已有研究证明当细菌的分裂被抑制而它们的生长仍在继续时细菌可转变成丝状体形态。研究发现幽门螺杆菌在高盐培养基中于静止早期可形成丝状体结构,胺曲南也可以诱导幽门螺杆菌丝状体的形成。因此,对其丝状体的研究有可能发现幽门螺杆菌的细菌分裂检查点。基因组学和蛋白质组学技术都是整体的高通量的生物技术体系,它们的兴起推动了生命科学各个分支突飞猛进的发展。蛋白质是生命活动的直接执行者,由于翻译和转录后修饰的影响,mRNA水平的变化不能完全反映蛋白质丰度的变化。蛋白质组学研究是在整体水平上高通量的解析基因组所表达的体现生命活动特征的蛋白质的变化规律,并且蛋白质组学技术已被证实是研究细菌应对各种不同环境压力的生理性适应反应的有力工具,幽门螺杆菌的两个菌株（H.pylori26695和H.pyloriJ99）的全基因组序列已经测序完成,为了充分利用这些生物信息学资源,本研究通过高通量的比较蛋白质组学分析了幽门螺杆菌在酸,胆汁等压力条件下及幽门螺杆菌非分裂状态丝状体的蛋白质表达变化,旨在为阐明幽门螺杆菌在体内外的生存机制提供有价值的理论基础。本学位论文的主要研究内容及实验结果如下:一.幽门螺杆菌在无脲素存在时对酸性胁迫的蛋白质反应酸性胁迫是幽门螺杆菌在人胃内面临的最大挑战,当幽门螺杆菌暴露于酸性环境时,脲素酶系统是其保持胞内及胞质pH接近于中性的基本调节机制,然而,胃液内的脲素浓度往往在1mM左右,仅仅通过分解脲素不足以有效保证幽门螺杆菌应对酸的胁迫,因此推测幽门螺杆菌还存在其它的酸性调节机制。为了鉴定除脲素酶以外幽门螺杆菌存在的抗酸相关的蛋白分子,我们利用双向凝胶电泳技术比较了该细菌在pH7.4,6.0,5.0,4.0,3.0及2.0条件下暴露30分钟后的蛋白质表达谱,差异性的蛋白进行MALDI-TOF-TOF质谱分析,共得到36个具有不同功能的蛋白质分子的信息。这些蛋白参与产氨,分子伴侣,能量代谢,细胞外膜,信号调节等多种生物学功能,还有一些蛋白质的功能至今仍不清楚,然后我们对差异性的蛋白进行了SOM分析,结果显示幽门螺杆菌通过多种蛋白的改变响应酸性胁迫。二.幽门螺杆菌对人胆汁胁迫的蛋白质反应幽门螺杆菌对胆汁的耐受能力是其在人胃肠道的定植和存活的重要机制,由于胆汁返流入低pH的胃内可被酸化,因此本研究首先检测了胆汁酸化前后对幽门螺杆菌抑制能力的改变,结果显示胆汁的酸化后对幽门螺杆菌的抑制活性降低。然后,通过双向凝胶电泳得到幽门螺杆菌在正常条件下及在胆汁和酸化胆汁胁迫下的蛋白质表达谱,差异性蛋白进行MALDL-TOF-TOF质谱分析,结果发现与正常条件下的菌体蛋白相比,胆汁及酸化胆汁胁迫下的蛋白质表达谱的变化规律相似。胆汁和酸化胆汁的存在使幽门螺杆菌28个菌体蛋白质的表达发生变化,并且大多数蛋白是诱导表达。这些蛋白包括分子伴侣蛋白,参与铁离子储存的蛋白,趋化性蛋白,与能量代谢相关的酶类及编码鞭毛装置的蛋白等,这说明幽门螺杆菌通过对多种信号分子的调节应对胆汁和酸化胆汁的胁迫。为了证实某些蛋白在幽门螺杆菌胆汁耐受中的作用,我们构建了Hp0721和鞭毛马达开关蛋白的基因缺失突变株,经检测发现两个突变株对胆汁胁迫的抵抗力有所降低,说明这两个蛋白在幽门螺杆菌的胆汁调节反应中起一定作用。三.胺曲南诱导的非分裂状态幽门螺杆菌丝状体的蛋白质组学分析处于压力环境中,细菌可进入非分裂状态,这在医学上具有重要意义。本研究利用胺曲南诱导了非分裂状态的幽门螺杆菌丝状体,细胞分裂时FtsI基因编码细胞壁上参与肽聚糖交联的一种转肽酶,是一种青霉素结合蛋白,胺曲南可抑制该蛋白的功能从而阻止细胞分裂。我们运用实时荧光定量PCR检测了FtsI和其它几个青霉素结合蛋白（Hp0597,Hp1565,Hp1372,Hp1373）在幽门螺杆菌丝状体中的表达情况,结果显示FtsI在幽门螺杆菌丝状体中低表达,而其它几个青霉素结合蛋白的表达水平与螺杆状细菌相比并无明显差异。为了寻找幽门螺杆菌可能存在的其它细胞分裂检查点,我们利用双向凝胶电泳技术比较了能够正常分裂的螺杆状和处于非分裂状态的幽门螺杆菌丝状体的蛋白质表达谱,在丝状体中具有差异表达的蛋白质斑点通过MALDI-TOF-TOF质谱分析,得到21个蛋白质的信息。其中有一个与细胞分裂相关的蛋白在幽门螺杆菌丝状体中被诱导表达,该蛋白是由MinD基因编码的一种细胞分裂抑制因子,通过序列比较发现该蛋白与大肠杆菌的相应蛋白具有50%的同源性。我们构建了MinD基因缺失的幽门螺杆菌26695突变株,形态学观察发现该基因的缺失使得部分菌体转变为小细胞型（mini cell）,幽门螺杆菌的生长率和存活率降低,这可能是由于这种小细胞型细菌无细胞核,没有增殖能力所致。