论文摘要
第一章香烟暴露肺气肿小鼠CD4+白细胞介素-17+辅助性T细胞的变化及意义目的观察香烟烟雾暴露小鼠肺实质、外周血中CD4+IL-17+辅助性T细胞（Th17）数量及转录因子RORγt的表达情况,以探讨其在香烟诱导小鼠肺部炎症及肺气肿中的作用。方法将40只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:对照12周组（C12）、对照24周组（C24）、烟雾暴露12周组（S12）、烟雾暴露24周组（S24）,每组10只。香烟烟雾暴露法建立小鼠肺气肿模型。HE染色观察小鼠肺气肿的改变,计算平均内衬间隔（Lm）和肺泡破坏指数（DI）;酶联免疫吸附法检测小鼠支气管肺泡灌洗液及肺实质中干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平;流式细胞术检测小鼠肺实质、外周血中CD4+IL-17+T（Th17）细胞占CD4+T细胞的百分比;免疫荧光PCR法检测小鼠肺实质、外周血中RORγt和IL-17的mRNA表达,并分析这些指标的相互关系。结果（1） S12组和S24组Lm为[（39.19±3.51）μm和（46.87±7.16）μm]及DI为[（39.13±1.57）和（45.16±3.13）]均明显高于C12组和C24组Lm [（32.60±3.21）μm和（32.38±3.73）μm]及DI [（28.23±1.62）和（28.86±2.07）],以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2） S12组和S24组BALF中IFN-γ及TNF-α水平[（129.7±22.2） ng/L和（251.1±62.4）ng/L]及[（17.35±1.60）ng/L和（36.35±1.43）ng/L]较C12组和C24组[（85.8±26.8）ng/L和（88.9±11.5）ng/L]及[（6.41±0.90）ng/L和（5.85±0.92）ng/L]明显增高;在肺实质中,S12组和S24组IFN-γ及TNF-α水平[（1124.3±174.4）ng/L和（1342.7±206.1）ng/L]及[（77.2±13.7）ng/L和（101.7±19.0）] ng/L亦较C12组和C24组[（946.2±81.9）ng/L和（1027.2±188.3）ng/L]及[（62.1±16.1）ng/L和（64.4±15.1）ng/L]明显增高;且以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3） S12组和S24组肺实质中Th17细胞比例[（3.27±1.12）%和（7.19±2.24）%]明显高于C12组和C24组[（1.80±0.75）%和（1.99±0.59）%];S12组和S24组外周血中Th17细胞比例[（1.96±0.61）%,和（3.82±1.26）%]亦明显高于C12组和C24组[（0.90±0.37）%,和（0.97±0.32）%];且以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（4） S12组和S24组肺实质中RORγt和IL-17 mRNA表达量[（25.40±3.57）和（ 35.40±3.20）],[（25.50±3.03）和（35.50±3.03）]较C12组和C24组[（10.00±4.83）和（11.20±7.35）], [（12.70±5.12）和（8.30±6.07）]明显增高,以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义（均P<0.05）;外周血中,S12组和S24组RORγt和IL-17 mRNA表达量[（24.90±4.63）和（35.20±3.61）], [（25.70±3.34）和（35.30±3.40）]亦较C12组和C24组[（9.00±5.73）和（12.90±7.22）],[（12.10±6.59）和（8.90±4.98）]明显增高,以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（5）烟雾暴露组中,外周血和肺实质的Th17细胞比例均与Lm、DI值显著正相关（r值分别为0.767、0.772;0.722、0.706,均P<0.05）。结论Th17细胞在香烟暴露肺部炎症、肺气肿小鼠外周血及肺内表达增高,并伴活性的增强,且随烟雾暴露时间延长而增强,提示香烟暴露肺气肿小鼠Th17细胞上调可能是导致小鼠肺内及全身炎症反应放大的原因之一。第二章CD4+白细胞介素-17+辅助性T细胞在香烟暴露肺气肿小鼠中上调的相关研究目的观察香烟烟雾暴露肺气肿小鼠肺实质中CD4+IL-17+辅助性T细胞（Th17）及相关分子的变化,探讨其在香烟暴露肺气肿小鼠中上调的可能机制。方法将40只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:对照12周组（C12）、对照24周组（C24）、烟雾暴露12周组（S12）、烟雾暴露24周组（S24）,每组10只。香烟烟雾暴露法建立小鼠肺气肿模型。HE染色观察小鼠肺气肿的改变,计算平均内衬间隔（Lm）和肺泡破坏指数（DI）;流式细胞术检测小鼠肺实质中CD4+IL-17+T（Th17）细胞、CD4+IFN-γ+T（Th1）细胞、CD4+IL-17+IFN-γ+T（Th17/ Th1）细胞、CD4+IL-17+CCR6+T细胞及CCR6+ Th17细胞比例;酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠肺实质中的IL-1β、IL-6、IL-23、转化生长因子（TGF-β）、IFN-γ及CCL20水平,并分析这些指标的相互关系。结果（1） S12组和S24组小鼠Lm为[（39.19±3.51）μm和（46.87±7.16）μm]及DI为[（39.13±1.57）和（45.16±3.13）]均明显高于C12组[（32.60±3.21）μm和（28.23±1.62）]及C24组[（32.38±3.73）μm和（28.86±2.07）] ,以S24组增高更为显著（t值为4.37815.188,均P<0.05）。（2） S12组和S24组小鼠Th17、Th17/Th1和Th1细胞比例[（3.27±1.12）和（7.19±2.24）] , [（0.61±0.30）和（1.82±0.52）],[（10.02±3.68）和（26.21±6.04）]均明显高于C12组和C24组[（1.80±0.75）和（1.99±0.59）] , [（0.27±0.12）和（0.28±0.11）] , [（3.75±1.72）和（4.16±1.32）],且以S24组增高更为显著（t值为3.46113.356,均P<0.01）;S12组、S24组中小鼠Th17、Th17/Th1及Th1细胞比例与Lm、DI值均显著正相关（r值为0.7060.877,均P<0.01）。（3） S12组和S24组小鼠CD4+IL-17+CCR6+细胞比例[（0.69±0.34）和（1.11±0.48）]明显高于C12组和C24组[（0.22±0.18）和（0.25±0.17）],以S24组增高更为显著（t值为2.2385.270,均P﹤0.05）;S12组和S24组小鼠CCR6+Th17细胞比例[（12.23±2.13）和（18.65±1.17）]高于C12组和C24组[（6.55±2.13）和（7.29±1.57）],以S24组增高更为显著（t值为5.95018.342,均P<0.05）;烟雾暴露组小鼠CCR6+ Th17细胞比例与Lm和DI值显著正相关（r值分别为0.617,0.741,均P<0.05）。（4） S12组和S24组小鼠肺实质中IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-23、TGF-β及CCL20浓度均明显高于C12组和C24组,以S24组增高更为显著（t值为1.51717.257,均P﹤0.01）;S12组和S24组中Th17细胞比例与IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-23、TGF-β及CCL20浓度之间均呈显著正相关关系（r值为0.3940.800,均P<0.05）。结论香烟暴露肺气肿小鼠肺内Th17、Th17/Th1和Th1细胞上调,IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-23、TGF-β的升高及CCR6/CCL20趋化轴作用可能与Th17细胞上调相关。第三章香烟暴露肺气肿小鼠中CD4+白细胞介素-17+辅助性T细胞对CD8+T细胞毒性功能的影响目的观察香烟烟雾暴露小鼠外周血、肺实质中CD4+IL-17+辅助性T细胞（Th17）上IL-21的表达情况,研究IL-21对CD8+T细胞功能的影响,以探讨Th17细胞对香烟诱导肺气肿的调节机制。方法将40只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:对照12周组（C12）、对照24周组（C24）、烟雾暴露12周组（S12）、烟雾暴露24周组（S24）,每组10只。香烟烟雾暴露法建立小鼠肺气肿模型。HE染色观察小鼠肺气肿的改变,计算平均内衬间隔（Lm）和肺泡破坏指数（DI）;流式细胞术检测小鼠外周血、肺实质中CD4+IL-17+IL-21+细胞及CD8+IL-21R+细胞比例;分离C24组和S24组小鼠脾细胞的CD8+T细胞,分4组:对照24周IL-21共培养组（C24IL-21+组）、烟雾暴露24周IL-21共培养组（S24IL-21+组）、对照24周空白组（C24IL-21-组）及烟雾暴露24周空白组（S24IL-21-组）,进行体外培养,通过流式细胞术检测CD8+穿孔素+T细胞、CD8+粒酶B+ T细胞的比例及酶联免疫吸附法检测培养上清液中穿孔素和粒酶B水平。结果（1） S12组和S24组小鼠Lm为[（39.19±3.51）μm和（46.87±7.16）μm]及DI为[（39.13±1.57）和（45.16±3.13）]均明显高于C12组[（32.60±3.21）μm和（28.23±1.62）]及C24组[（32.38±3.73）μm和（28.86±2.07）] ,以S24组增高更为显著,差异均有统计学意义（t值为4.37815.188,均P<0.05）。（2）在外周血中,S12组和S24组小鼠CD4+IL-17+IL-21+细胞比例[（ 0.18±0.04）%和（0.53±0.22）%]明显高于C12组和C24组[（0.06±0.03）%和（ 0.08±0.03）%],以S24组增高更为显著,差异均有统计学意义（均p<0.05）;S12组和S24组小鼠CD8+IL-21R+细胞比例[（2.35±0.75）%和（3.14±1.35）%]明显高于C12组和C24组[（0.59±0.21）%和（0.61±0.18）%],但S12组和S24组间差异无统计学意义（p>0.05）;烟雾暴露组小鼠外周血中CD4+IL-17+IL-21+细胞比例及CD8+IL-21R+细胞比例均与Lm、DI值显著正相关（r值为0.5200.668,均p<0.05）。在肺实质中,S12组和S24组小鼠CD4+IL-17+IL-21+细胞比例[（0.19±0.04）%和（0.55±0.24）%]明显高于C12组和C24组[（0.07±0.03）%和（0.08±0.03）%],S24组增高更为显著,差异均有统计学意义（均p<0.05）;S12组和S24组小鼠CD8+IL-21R+细胞比例[（2.94±1.26）%和（4.12±2.26）%]亦明显高于C12组和C24组[（ 1.22±0.31）%和（1.34±0.18）%],但S12组和S24组间差异亦无统计学意义（ p>0.05 ）;烟雾暴露组小鼠肺实质中CD4+IL-17+IL-21+细胞比例及CD8+IL-21R+细胞比例均与Lm、DI值显著正相关（r值为0.5160.754,均p<0.05）。（3） C24IL-21+组和S24IL-21+组小鼠CD8+perforin+T细胞比例为[（58.68±7.87）和（76.06±5.19）]及CD8+granzyme B+ T细胞比例为[（42.70±5.72）和（71.13±4.97）]均明显高于C24IL-21-组[（23.28±3.41）和（20.27±3.35）]及S24IL-21-组[（29.19±6.81）和（25.36±5.78）] ,以S24IL-21+组增高更为显著（t值为2.40918.987,均P<0.05）;在培养细胞上清液中, C24IL-21+组和S24IL-21+组小鼠穿孔素的浓度为[（17.54±1.80）ng/L和（24.47±2.61） ng/L]及粒酶B的浓度为[（1.43±0.18） ng/L和（1.92±0.21） ng/L]均明显高于C24IL-21-组[（5.23±2.02） ng/L和（0.84±0.07） ng/L]及S24IL-21-组[（9.24±1.12） ng/L和（1.35±0.20） ng/L] ,以S24IL-21+组增高更为显著（t值为5.50216.950,均P<0.05）;且各组穿孔素的浓度显著高于粒酶B浓度（均P<0.05）。结论香烟暴露导致肺气肿小鼠外周血、肺内CD4+IL-17+IL-21+细胞及CD8+IL-21R+细胞上调, Th17细胞通过IL-21/IL-21R促进肺部炎症放大及组织破坏,这对探讨COPD肺部炎症和肺气肿发生机制以及为COPD的免疫学治疗提供了新的策略。
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