用Real Time PCR和DGGE技术研究放牧藏系绵羊瘤胃微生物季节动态

论文摘要

藏系绵羊主要分布于西藏、青海、甘肃和四川等高寒地区,是具有特殊遗传特性的动物,是当地牧民生活的物质基础和经济来源。与其它反刍动物一样,藏羊在进化过程中获得的前胃发酵功能也非常完善和高效。与其它反刍动物不同的是,藏羊所生存环境的更加恶劣,饲料来源更加困难,饲料的营养成分也更加贫乏,但环境胁迫使其对饲料的利用更为高效,瘤胃的发酵功能更为完善,为它的生存提供了重要保障。研究瘤胃微生物的目的,是为了了解它们的形态、生理、繁殖、地理分布、种群相互作用及与宿主之间的相互依赖关系,为合理利用饲草、饲料资源提供依据。本论文对不同季节青藏高原放牧藏系绵羊瘤胃细菌、真菌、甲烷菌和琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）的数量动态变化进行了研究,并分别对不同季节藏系绵羊瘤胃细菌和古细菌区系的动态进行了研究。共进行了以下四个试验:试验一:采用模拟采食,结合尼龙袋法的方法,测定了试验羊放牧地（青海三角城种羊场）冬春季、夏季和秋季各牧场的牧草营养成分、放牧采食量和消失率。结果表明:牧草营养成分（混合草样）随季节变化,其中粗蛋白质、能量含量均为夏季>秋季>冬春季;中性洗涤纤维,酸性洗涤纤维含量为夏季<秋季<冬春季。春、夏、秋和冬季牧草干物质的消失率分别为:48.81±8.25%、52.07±1.03%、51.43±3.05%、50.28±1.23%。春、夏、秋和冬季绵羊CP、ME食入量为:2.63±0.01g/kgW0.75·d、0.41±0.00 MJ/kgW0.75·d,12.80±0.08g/kgW0.75·d、1.33±0.01MJ/kgW0.75·d,6.39±0.03g/kgW0.75·d、0.57±0.002 MJ/kgW0.75·d,4.05±0.01 g/kgW0.75·d、0.39±0.003 MJ/kgW0.75·d。试验二:以青藏高原环青海湖地区藏系绵羊瘤胃内容物为样品,以获取尽可能全面代表瘤胃微生物种类、不被其它来源DNA污染的可用于分子生物学研究的总DNA为目的,采用改进后的液氮反复冻融+CTAB法提取微生物总DNA。提取瘤胃微生物总DNA长度在23Kb以上,OD260/OD280均在1.59-1.68。用细菌和古细菌的16S rDNA通用引物和特异引物,从纯化前后瘤胃微生物总DNA中成功扩增出目标条带,表明该法能充分破碎包括细菌、真菌在内的各种瘤胃微生物细胞壁。试验三:以青藏高原环青海湖地区藏系绵羊瘤胃内容物样品总DNA,研究不同季节藏系绵羊瘤胃微生物的季节变化。采用Real Time PCR技术,利用国际原子能机构提供的细菌、真菌、产甲烷菌和琥珀酸丝状杆菌的引物,在建立了瘤胃微生物

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致谢

中文摘要

ABSTRACT

前言

第一篇文献综述

第一章瘤胃微生物的种类及特点

1.1 细菌的特点及其在瘤胃发酵中的作用

1.1.1 产甲烷菌的特点及其在瘤胃发酵中的作用

1.1.2 琥珀酸丝状杆菌的特点及其在瘤胃发酵中的作用

1.2 真菌的特点及其在瘤胃发酵中的作用

1.3 瘤胃原虫的特点及其在瘤胃发酵中的作用

第二章微生物间的相互关系

第三章影响瘤胃微生物数量的因素

3.1 年龄因素

3.2 动物品种

3.3 饲料供给技术

3.4 采食水平

3.5 季节与地域影响

第四章瘤胃微生物的定量研究方法

4.1 传统定量方法

4.1.1 稀释平板计数法

4.1.2 最大或然数法

4.2 传统瘤胃微生物定量方法的缺点

4.3 分子生物学定量方法

4.3.1 点杂交和狭线杂交

4.3.2 变性（或温度）梯度凝胶电泳

4.3.3 定量PCR 技术

4.3.3.1 竞争定量PCR

4.3.3.2 Real Time-PCR

4.3.3.2.1 Real Time-PCR 的原理

4.3.3.2.2 荧光标记法种类

4.3.3.2.3 双链DNA 结合染料

4.3.3.2.4 分子信标（molecular beacon）

4.3.3.2.5 杂交探针

4.3.3.2.6 TaqMan 探针

4.3.3.3 定量方法

4.3.3.3.1 Ct （threshold cycle）

4.3.3.3.2 标准曲线制作及未知样品的定量

4.3.3.3.3 Real Time-PCR 优点

4.3.3.3.4 Real Time-PCR 在瘤胃微生物研究中的应用

第五章瘤胃微生物多样性研究方法

5.1 直接测定微生物16S rRNA 序列

5.2 单链构象多态性分析（SSCP）

5.3 限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）

5.4 特异RNA 探针杂交

5.5 DGGE 技术

5.5.1 DGGE 技术在瘤胃微生物群落研究中的应用

5.5.2 DGGE 技术的优点

第二篇试验研究

第一章放牧地牧草营养分成的季节变化

前言

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

1.2 试验地概况

1.3 试验羊放牧地主要植物群落类群及其分布特征

1.4 植物样品的采集与测定

1.5 尼龙袋法试验

1.5.1 尼龙袋的投放

1.5.2 尼龙袋处理

1.5.3 各营养成分消失率计算

1.6 放牧采食量的测定

1.7 放牧藏系绵羊瘤胃pH 值测定

1.8 样品处理及分析

1.9 统计方法

2 结果

2.1 牧草的营养成分含量及营养价值

2.2 放牧绵羊采食量和消化率动态

2.3 不同季节放牧绵羊瘤胃pH 值

3 讨论

3.1 季节对牧草的营养成分含量及营养价值的影响

3.2 季节对放牧绵羊采食量和消化率影响

4 小结

第二章藏系绵羊瘤胃微生物总DNA 的提取

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藏系绵羊瘤胃内容物

1.1.2 生化试剂

1.1.3 主要仪器

1.1.4 主要分子生物试剂配制

1.1.5 引物

1.2 方法

1.2.1 瘤胃内容物的采集与处理

1.2.2 DNA 提取方法

1.2.3 DNA 的纯化

1.2.4 DNA 提取质量检测

2 结果分析

2.1 瘤胃微生物DNA 的提取

2.2 瘤胃微生物总DNA 的纯化

3 讨论

4 小结

第三章用Real time-PCR 技术研究藏系绵羊瘤胃微生物季节变化

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR 定量检测不同季节瘤胃总细菌

1.2.2 Real-time PCR 定量检测不同季节瘤胃产甲烷菌总量

1.2.3 Real-time PCR 定量检测不同季节瘤胃真菌总量

1.2.4 Real-time PCR 定量检测不同季节瘤胃琥珀酸丝状杆菌总量

1.3 数据统计与分析

2 结果

2.1 瘤胃细菌16S rDNA Real Time PCR

2.1.1 瘤胃细菌16S rDNA Real Time PCR 标准曲线制作

2.1.2 模板浓度优化

2.1.3 瘤胃细菌Real Time PCR 标准曲线

2.1.4 不同季节藏系绵羊瘤胃细菌Real Time PCR 的定量

2.2 Real Time PCR 定量检测不同季节藏系绵羊瘤胃产甲烷菌

2.2.1 瘤胃产甲烷菌Real Time PCR 标准曲线

2.2.2 不同季节藏系绵羊瘤胃产甲烷菌Real Time PCR 的定量

2.3 Real Time PCR 定量检测不同季节藏系绵羊瘤胃真菌

2.3.1 瘤胃真菌Real Time PCR 标准曲线

2.3.2 不同季节藏系绵羊瘤胃真菌Real Time PCR 的定量

2.4 Real Time PCR 定量检测不同季节藏系绵羊瘤胃琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）

2.4.1 标准曲线

2.4.2 不同季节藏系绵羊瘤胃琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）Real Time PCR 的定量

3 讨论

3.1 标准曲线的制备

3.2 季节变化对藏系绵羊瘤胃微生物数量的影响

3.2.1 季节变化对藏系绵羊瘤胃细菌数量的影响

3.2.2 季节变化对藏系绵羊瘤胃产甲烷菌数量的影响

3.2.3 季节变化对藏系绵羊瘤胃真菌数量的影响

3.2.4 季节变化对藏系绵羊瘤胃琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）数量的影响

3.3 微生物之间的相互作用

4 小结

第四章变性梯度凝胶电泳法研究藏系绵羊瘤胃微生物季节变化

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 计算机分析

2 结果与分析

2.1 不同季节藏系绵羊瘤胃细菌DGGE 图谱分析

2.2 不同季节瘤胃细菌区系DGGE 图谱相似性分析

2.3 不同季节瘤胃细菌群体变化规律

2.4 不同季节藏系绵羊瘤胃细菌多样性分析

2.5 不同季节藏系绵羊瘤胃古细菌DGGE 图谱分析

2.6 不同季节瘤胃古细菌区系DGGE 图谱相似性分析

2.7 不同季节藏系绵羊瘤胃古细菌多样性分析

3 讨论

3.1 季节对瘤胃细菌的影响

3.2 季节对瘤胃古细菌的影响

3.3 微生物之间的相互作用对细菌和古细菌多样性的影响

4 小结

第五章总结论

第六章论文创新点及需进一步研究的问题

创新点

需进一步研究的问题

主要参考文献

个人简介

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导师简介

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