论文摘要
目的电压门控性钠通道（Voltage-gated sodium;channel;VGSC）是在可兴奋细胞的动作电位初期调节钠离子通透性的一种跨膜蛋白,它具有电压依赖性激活、迅速失活和选择性离子传导三个特性,钠通道广泛存在于可兴奋细胞（如神经细胞、心肌细胞）中,具有去极化和传播动作电位的作用,故钠通道在维持细胞的兴奋性和正常生理功能上起着重要的作用,同时它还是许多药物作用的靶点。目前已经明确,哺乳动物电压门控性钠通道包含众多的家族,这些蛋白由一个α亚单位和β1,β2,β3和β4四个不同的β亚单位组成,其中,α亚单位可单独发挥生理作用,β亚单位只起辅助和调节作用。现在,在人和大鼠中代码这个家族α亚单位的基因Nav1.1～Nav1.9已经被发现并根据统一命名法命名。Nav1.5钠通道是河豚毒抵抗型钠通道,曾被认为只是心肌的主要离子通道,近些年也被发现表达在脑组织、前列腺、肾上腺、甲状腺、骨骼肌、肺、子宫等处。近年来已经阐明,钠通道的基因突变引起的蛋白结构和/或功能的改变,在一些疾病的病理变化中起着重要的作用,如高血钾性周期性麻痹、家族遗传性癫痫、婴儿猝死综合征（sudden infant death syndrome,SIDS）、青壮年猝死综合征（Suddenunexplained death syndrome,SUDS）、先天性长QT综合征（LQT3）、Brugada综合症和自发性心室纤颤（idiopathic ventricular fibrillation,IVF）等,其中,后五者已被证实与Nav1.5/SCN5A的基因突变有关。离子通道的研究已成为生命科学中的一个重要领域,运用生物物理、生物化学、分子遗传学、细胞生物学等方法将通道结构和功能联系起来进行深入研究,阐明闸门控制、离子选择性、药物作用的分子机制是一项迫切而重要的工作。尽管大鼠Nav1.5钠通道心肌和人神经母细胞瘤α亚单位序列已经被成功克隆,且Nav1.5钠通道也被发现在正常脑组织分布,但是脑组织Nav1.5钠通道α亚单位氨基酸序列结构如何,与心肌是否有同源性,与人神经母细胞瘤Nav1.5钠通道α亚单位有无区别,脑组织Nav1.5钠通道α亚单位存在多少选择性剪切和异构体,其功能有无差别,在大鼠脑组织中不同发育阶段的各脑叶的分布如何等均未见报导,因此,我们将克隆大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位并检测其在不同发育阶段各脑叶的分布,这对神经和心脏钠通道电生理功能的进一步研究,对以后由神经和心脏钠通道引起的各种疾病的诊断和治疗奠定了一定的基础。材料和方法一、材料与试剂雄性wistar大鼠购自辽宁省动物实验中心;RNAOUT试剂盒购自天泽基因工程有限公司;RT—PCR试剂盒、限制性内切酶购自TaKaRa公司;DNA纯化试剂盒、pGEM-TEasy克隆载体、T4连接酶、感受态细胞、质粒提取试剂盒购自Pharmacia公司。二、实验方法（一）RNA提取和逆转录参照有关文献标准,取雄性大鼠出生0天、9天、18天、36天、72天各5只,采用断颈处死,迅速取出脑组织,均分别取大脑、小脑、脑干、海马各一块标本,同时取9天和72天大鼠心肌各一块标本作RNA提取。使用AMV反转录酶,配制反转录反应液合成cDNA的第一条链,按下列组成配制反转录反应液:MgCl22μl、10×RT Buffer 1μl、RNase Free dH2O 3.75μl、dNTP Mixture（各10mM）1μl、RNase Inhibitor 0.25μl、AMV Reverse Transcriptase 0.5μl、Random 9 mers 0.5μl、Sample RNA 1μl。反转录反应条件如下:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。（二）大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位的克隆PCR引物A1～A8根据己知大鼠心肌Nav1.5钠通道（rH1）及人神经母细胞瘤Nav1.5钠通道（hNbR1）的基因序列设计共8对,cDNA均取自72天大鼠大脑,A1～A8这8个片段包含大鼠Nay1.5钠通道α亚单位的全部编码区域,扩增反应为94℃2min,随后是94℃30s,60-72℃30s和72℃1min,共40个循环,以72℃7min结束。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中经电泳分离,预期PCR片段从琼脂糖凝胶中切割并纯化,用T4 DNA连接酶亚克隆至pGEM-T-easy载体上,于16℃连接15h并转化至感受态细胞上,37℃摇床1h,取上述菌液涂IPTG-X-gal LB平板（Amp100μg/ml）,37℃电热培养箱倒置过夜培养。随机挑取1个白色菌落于5mlLB培养基37℃摇床过夜,经碱裂解法提取质粒,使用双脱氧核酸链终止法,在DNA序列仪上行序列分析。（三）竞争性聚合酶链反应应用上述PCR方法,分别使用30、35、40个不同循环对第5对引物（A5）进行大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位rN1（769bp）及其异构体（剪切Exon20）rN1-2（660bp）的竞争性PCR反应,PCR反应体系包括:模板cDNA（均取自出生后72天大鼠大脑）10μL、5×PCR Buffer 10μl、灭菌蒸馏水28.75μl、TaKaRa ExTaq HS 0.25μl、上游特异性PCR引物0.5μl、下游特异性PCR引物0.5μl,扩增反应为94℃2min,随后是94℃30s,60～72℃30s和72℃1min,共40个循环,以72℃7min结束。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,并经scion image软件分析,观察各自在脑组织中的信号强度。（四）大鼠脑组织NaV1.5钠通道α亚单位在不同发育阶段各脑叶的分布引物B1（779bp）根据已知大鼠心肌Nav1.5钠通道α亚单位序列设计,所选引物可与其他钠通道序列相区别,PCR反应体系同上,模板cDNA分别取雄性大鼠出生0天、9天、18天、36天、72天的海马、脑干、小脑、和大脑,同时取9天和72天大鼠心肌cDNA作对比,均分别行35和40个循环扩增,扩增反应为94℃2min,随后是94℃30s,62℃30s和72℃1min,均分别行35和40个循环,以72℃7min结束。PCR反应的同时使用β-actin引物作为阳性对照,PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,并经scion image软件分析。三、统计学分析采用SPSS15.0软件进行统计学分析,采用One-Way ANOVA检验,P＜0.05为有显著性差异。结果一、大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位的克隆本实验得到的cDNA全长为6093bp,并命名为rN1（登录号EF618549）,rN1的开放阅读框架（open reading frame,ORF）编码2016个氨基酸,氨基酸序列分析显示具有电压依赖性钠通道的结构特点:4个相似的跨膜结构域（DⅠ～DⅣ）,其中包括6个跨膜片段（S1～S6）,每个结构域的电压感受器跨膜片段（S4）均有正电荷残基,rN1与rH1相比,有70个氨基酸不同,相似性为96.53%。与hNbR1相比有78个氨基酸不同,相似性为96.13%。二、大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位选择性剪切在使用引物对A1时,发现rN1在rH1第8外显子相应区域的核苷酸序列有明显的不同,分别是:T206V,T207S,F209N,V210I,D211K,V215L,S234P,与Nav1.5/SCN5A钠通道基因组序列比对结果显示,rH1的第8外显子位于第8号染色体,其基因组序列位于20731～20822,而rN1的相应部分也位于第8号染色体,其基因组序列却位于20975～21066,提示另外一种选择性剪切,基因组序列对比结果显示rN1该段序列位于Nav1.5/SCN5A第7外显子区域,该外显子具有典型的内含子/外显子边界,3′端是（C/T）AG和5′端是GT（A/G）,提示为一新的外显子,故命名其为第7外显子（登录号:EF502023）,这一结果显示rN1由于选择性剪切编码了第7外显子,而不是第8外显子;在使用A5引物对时,电泳后同时出现了比预期条带分子质量略小的另一条带,基因测序证实为剪切了第20外显子（53个氨基酸）的新的变构体,将其命名为rN1-2（登录号:EF618550）,我们使用A5引物对行30、35、40循环竞争性PCR,并经电泳结果分析证实,rN1和rN1-2在大鼠脑组织中表达无明显差别。三、大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位在不同发育阶段、各脑叶的分布大鼠大脑、小脑、脑干Nav1.5钠通道在同一发育阶段无明显区别,但随不同发育阶段的增长,Nav1.5钠通道的表达逐渐增多（P＜0.01）,但海马在出生后0和9天Nav1.5钠通道表达明显高于其他脑叶,随不同发育阶段的增长无明显增长,出生72天还略下降,同时,我们选取β-actin作为内参,结果显示,β-actin在各不同发育阶段各脑叶表达无明显差异（P＞0.05）。四、大鼠大脑与心肌Nav1.5钠通道α亚单位的表达对比为了证实各个不同发育阶段大鼠脑组织和心肌Nav1.5钠通道表达的差别,我们选取了成年和幼年大鼠的大脑和心脏分别行40循环PCR检测,电泳结果证实,Nav1.5钠通道的表达趋势是成年大鼠心脏＞幼年大鼠心脏＞成年大鼠大脑＞幼年大鼠大脑。结论1、成功克隆大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位,充分证明了Nav1.5钠通道不是大鼠心肌独有的结构。2、大鼠脑组织存在第7和20外显子的选择性剪切,可能是大鼠脑组织的生理和功能的重要基础,可能是大鼠脑组织与大鼠心肌功能不同的因素之一。3、虽然大鼠在全脑均有Nav1.5钠通道分布,但在不同发育阶段不同脑叶分布是有明显差别的,大脑、小脑、脑干中同一发育阶段中的表达无明显变化,但大脑、小脑、脑干钠通道表达随着不同发育阶段的增长逐渐增多。4、海马在不同发育阶段与其他脑叶相比表达明显不同,表明Nav1.5钠通道在边缘系统可能发挥独特的功能和作用。5、Nav1.5钠通道确实是心肌的主要钠通道,在大鼠心肌的表达明显多于脑组织,其表达趋势是成年大鼠心脏＞幼年大鼠心脏＞成年大鼠大脑＞幼年大鼠大脑。