几种赤潮藻抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立和应用

论文摘要

本研究选取我国近海常见的十九种赤潮藻为研究对象,通过免疫家兔制备了它们的多克隆抗体。对这些抗体进行效价测定和特异性鉴定后,选取了特异性好的几种分别建立了相应海藻的间接竞争型酶联免疫检测方法,并在模拟天然海水样品的检测中取得了比较理想的结果。 通过用旋链角毛藻细胞免疫小鼠、产蛋鸡和家兔,结果发现三种动物均产生了抗旋链角毛藻的多克隆抗体,不同的免疫程序对抗体的产生和抗体的特异性影响不大。其中兔抗体制备的时间较短,效价高,且抗体的总量大,因此在十几种赤潮藻的多克隆抗体制备过程中,采用家兔作为接受免疫的对象。对制备的十几种赤潮藻的多克隆抗体分析后发现,所有抗体均表现高亲和力,效价最低的为6000,最高的达到69000;多数抗体特异性不好,与其他海藻显示一定的交叉反应,但有几种海藻的抗血清与其他海藻交叉反应很小或者没有;通过适当的吸附封闭法处理多克隆抗体,可以有效降低某些多克隆抗体与其他海藻的交叉反应。 本研究选取特异性较好、具有高效价的抗柔弱角毛藻抗血清、抗赤潮异弯藻抗血清、抗海洋原甲藻抗血清和抗红色裸甲藻抗血清,分别建立了相应海藻的竞争型酶联免疫检测方法。抗柔弱角毛藻抗血清对角毛藻属旋链角毛藻、柔弱角毛藻、纤细角毛藻和微型角毛藻均可以很好的识别,具有一定的属特异性,最低检测数目达到51个细胞左右。其他三种抗血清均显示种特异性,在竞争ELISA试验中,最低检测细胞数目在几十到几百个之间,其中赤潮异弯藻和海洋原甲藻的最低检测数目分别达到了77个和55个细胞左右。利用这些抗血清和ELISA方法,对几份模拟海水样品中的藻细胞进行了定量检测,和光镜直接计数的结果比较后发现,两者基本一致。此外,还对间接ELISA在浮游微藻检测中的应用作了初步探讨。

论文目录

• 1 文献综述
• 1.1 赤潮及其危害
• 1.2 鉴别和计量赤潮藻的主要技术与方法
• 1.2.1 基于形态学特征的检测方法
• 1.2.2 基于核酸探针的检测技术
• 1.2.3 基于流式细胞术的检测方法
• 1.2.4 基于抗体探针的免疫学检测方法
• 1.3 免疫学方法在有害藻检测中的应用
• 1.3.1 免疫荧光检测
• 1.3.2 免疫磁性微粒
• 1.3.3 免疫传感技术
• 1.3.4 免疫酶测定
• 1.3.5 免疫流式细胞术
• 1.3.6 单克隆抗体和封闭抗体
• 1.4 酶联免疫分析技术简介
• 1.4.1 ELISA的原理
• 1.4.2 ELISA的类型
• 1.5 小结
• 2 赤潮藻多克隆抗体的制备及特异性鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 海洋浮游微藻培养
• 2.2.2 主要试剂与溶液
• 2.2.3 免疫原制备
• 2.2.4 多克隆抗体制备
• 2.2.5 抗体的效价测定
• 2.2.6 海藻各组分与抗血清的结合试验
• 2.2.7 抗体的特异性测定
• 2.2.8 抗血清封闭试验
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 抗旋链角毛藻抗血清的效价分析
• 2.3.2 其他几种浮游微藻多克隆抗体的效价分析
• 2.3.3 细胞液及各组分与抗血清的结合性质研究（以具齿原甲藻为例）
• 2.3.4 多克隆抗体的特异性分析
• 2.3.5 抗体封闭试验
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 几种赤潮藻ELISA检测方法的建立和应用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 海洋浮游微藻培养
• 3.2.2 主要试剂与溶液
• 3.2.3 海藻细胞标准样品溶液的制备
• 3.2.4 竞争ELISA抗原和抗体工作浓度的确定
• 3.2.5 其他海藻对竞争ELISA检测的干扰
• 3.2.6 竞争ELISA试验的条件优化
• 3.2.7 模拟海水样品的竞争ELISA检测
• 3.2.8 藻细胞及其组分的间接ELISA检测试验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 赤潮异弯藻竞争ELISA检测方法的建立和样品分析
• 3.3.2 角毛藻属四种浮游微藻的竞争ELISA检测方法
• 3.3.3 海洋原甲藻和红色裸甲藻竞争ELISA检测方法的建立
• 3.3.4 柔弱角毛藻细胞的间接ELISA检测试验
• 3.4 讨论
• 3.4.1 浮游微藻酶联免疫检测方法的选择
• 3.4.2 影响ELISA检测的因素
• 3.4.3 关于间接ELISA和间接竞争ELISA
• 3.4.4 展望
• 3.5 小结
• 4 总结
• 参考文献
• 文章发表情况
• 致谢