基于PBK/TOPK、TTF-1、SPA表达检测的肺腺癌性与结核性胸腔积液的细胞病理学诊断及鉴别诊断研究

论文摘要

研究背景良、恶性胸水的鉴别一直是困惑临床医师的重要问题,在我国导致这两种胸水最常见的疾病是结核与肿瘤性疾病,后者主要为肺腺癌。肺癌和结核的治疗原则完全不同,有近20%的结核性和腺癌性疾病引起的胸水,在临床经全面检查后仍很难鉴别。因此,寻找直接或间接的肿瘤标记物或结核菌引起的炎症反应指标,以及探讨联合检测的诊鉴价值成为近年研究良、恶性胸水鉴别的热点之一。PBK/TOPK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的新成员,是一种丝/苏氨酸激酶,在有丝分裂期间活化及磷酸化,具有抗凋亡的作用。Fujibuchi T等发现PBK/TOPK的高表达不仅与肿瘤的恶性转化有关,而且还会促进这种恶性转化。本课题组利用免疫组织化学技术检测了760点阵肺癌组织芯片上PBK/TOPK蛋白的表达,发现肺腺癌细胞中PBK/TOPK的表达量较高,提示检测胸水中PBK/TOPK蛋白的表达对于肺腺癌性胸水的诊断可能具有临床探索价值。目前对于胸水中PBK/TOPK蛋白的表达情况及其在结核性和原发性肺腺癌性胸水中的鉴别诊断价值研究尚未见报道。TTF-1是一种组织特异性核转录因子,又称甲状腺特异性增强子结合蛋白,选择性表达于Ⅱ型肺泡细胞、细支气管上皮细胞、甲状腺滤泡细胞、甲状腺滤泡旁细胞以及胚胎时期脑部的前脑腹侧。虽然TTF-1特异表达于肺癌和甲状腺癌,但是甲状腺癌伴发胸水者罕见报道,因此TTF-1是目前检测肺癌性胸水较为理想的一种肿瘤标志物。有关胸水中TTF-1的表达研究多集中在细胞层面,或者是RNA方面,胸水中TTF-1蛋白的表达含量的研究仅见于定性的水平。SPA是肺表面活性物质相关蛋白的主要组成成分之一,Shijubo N最早提出通过检测患者胸水中SPA表达来鉴别原发性肺腺癌,证实SPA是原发性肺腺癌有价值的免疫组织化学标记,提示检测胸水中SPA蛋白的表达对于鉴别肺腺癌和肺结核应该具有重要意义。目的和意义观察PBK、TTF-1、SPA蛋白在肺腺癌性和结核性胸水中的表达情况,揭示其在这两类胸水中表达的差异及诊鉴意义,并且结合胸水生化检查,探讨有关指标单一以及联合检测对于肺腺癌性和结核性胸水的鉴别诊断价值及阂值。材料和方法一、A549细胞和GLC-82细胞的鉴定及其形态结构、免疫表型的定量分析实验材料：A549细胞株和GLC-82细胞株由病理学系液氮保存。研究方法：观察普通光镜下A549、GLC-82细胞的细胞爬片、HE和巴氏染色、细胞蜡块的形态结构,用Imagepro-Plus图像分析软件定量测试上述两株细胞及核的形态学参数；免疫细胞化学的方法和Leica Q500 MC图像分析系统定量测试两株细胞中CK7、CK8、CK5/6、CK19、Ki67、P53的表达PU值。从形态结构以及免疫表型方面对A549细胞和GLC-82细胞株进行鉴定并分析其相似性和差异性。二、A549和GLC-82中PBK/TOPK、TTF-1、SPA表达的定量分析实验材料：A549细胞株和GLC-82细胞株。研究方法：采用免疫细胞化学技术检测PBK/TOPK、TTF-1、SPA蛋白在A549和GLC-82细胞中的表达情况,用Leica Q500 MC图像分析系统测试PBK、TTF-1、SPA蛋白表达的阳性单位（PU）值,分析两株细胞中PBK、TTF-1、SPA的表达强度。三、肺腺癌性胸水和结核性胸水中PBK、TTF-1、SPA的表达及诊鉴意义分析实验材料：收集南方医院2009年9月-2010年10月符合诊断纳入标准的胸水94例：其中肺腺癌性胸水56例,年龄范围在34～85岁,平均为59.0±12.2岁；结核性胸水38例,年龄范围在14～84岁,平均为44.9±20.2岁。研究方法：收集胸水患者的临床资料。BCA法检测胸水中总蛋白的含量；采用western blotting法检测每例胸水标本中蛋白PBK/TOPK的表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测每例胸水中蛋白TTF-1、SPA的表达。应用受试者工作特征曲线（Receiver operation characteristic curve,ROC）分析确定PBK、TTF-1、SPA的最佳诊断阈值。采用并联和串联试验进行联合诊断试验综合分析。四、肺腺癌性和结核性胸水中PBK、TTF-1、SPA含量结合胸水生化检查的联合分析实验材料：同三（肺腺癌性胸水和肺结核性胸水中PBK、TTF-1、SPA表达及诊鉴意义分析）。研究方法：收集胸水患者在南方医院检验科之胸水生化检查的结果,包括：腺苷脱氨酶（ADA）、乳酸脱氢酶（LDH）、C反应蛋白（CRP）、葡萄糖（Glu）、白细胞计数（WBC）。结合胸水中的PBK、TTF-1、SPA的检测结果,探讨指标单一及联合检测对肺腺癌性和结核性胸腔积液的鉴别诊断价值。用诊断试验四格表求得不同的截断值和诊断参数,并结合受试者工作特征曲线（Receiver operation characteristic curve, ROC）分析确定最佳诊断阈值。诊断试验评价采用并联和串联试验进行。结果一、A549细胞和GLC-82细胞的鉴定及其形态结构、免疫表型的定量分析1、用Imagepro-Plus图像分析软件定量测试A549和GLC-82细胞的形态学参数,结果显示：GLC-82细胞的面积、细胞核的面积、胞浆面积、细胞与核的形状因子PE、ARc均大于A549细胞,而A549细胞的核浆比、核面积密度、核形状因子ARn、细胞与核的形状不规则指数均大于GLC-82细胞,两独立样本t检验显示其差异均具有显著性（P<0.002）。两株细胞的周长、核规化形状因子RFF差异无统计学意义（P>0.05）。2、A549细胞中CK7呈阳性表达,CK8呈强阳性表达,定位于胞浆和（或）胞膜。Ki67在A549细胞核中呈弥漫性阳性,P53细胞核中均呈散在性阳性；CK5/6、CK19不表达；GLC-82细胞中CK7呈阳性表达,CK8呈强阳性表达,定位于胞浆和（或）胞膜；Ki67在GLC-82细胞核中均呈弥漫性阳性,P53细胞核中呈散在性阳性。CK5/6、CK19不表达。通过免疫表型的鉴定,A549细胞和GLC-82细胞均为腺癌细胞。3、用Leica Q500 MC图像分析系统定量测试CK7、CK8、CK5/6、CK19、Ki67、P53在A549、GLC-82中的表达强度（PU值）。CK7、PBK、P53在A549细胞中的表达高于GLC-82细胞,而CK8、Ki67在GLC-82细胞中的表达高于A549细胞,差异有统计学意义（P=0.001）。二、A549和GLC-82中PBK/TOPK、TTF-1、SPA表达的检测结果PBK/TOPK在A549细胞和GLC-82细胞中均呈弥漫性阳性,定位于胞膜和胞浆,其中在A549细胞中的表达更强。SPA、TTF-1在A549细胞和GLC-82细胞中均不表达。A549细胞中PBK/TOPK表达的PU值（9.18±0.66）明显大于GLC-82细胞中PBK表达的PU值（4.77±2.31,P=0.000）。三、肺腺癌性胸水和结核性胸水中PBK/TOPK、TTF-1、SPA的表达及诊鉴意义分析1、BCA法检测的肺腺癌性胸水和结核性胸水的蛋白含量分别为（20.14±5.90）ug/ul和（18.0±±5.54）ug/u1,肺腺癌性胸水总蛋白含量明显高于结核性胸水,差异有统计学意义（P<0.05）。2、Western blotting检测胸水中的PBK/TOPK的表达,显影后在相对分子量43KD的位置出现了清晰的条带。采用Gel-Pro Analyzer图像分析软件分析得56例肺腺癌性胸水中PBK/TOPK表达的积分光密度值为319.23±127.84,明显高于38例肺结核性胸水中PBK/TOPK表达的积分光密度值192.34±136.53,差异有统计学意义（P=0.000）。应用受试者工作特征曲线（ROC curve）及标准化诊断试验评价方法分析PBK/TOPK对于腺癌性胸水的诊断试验结果,得到当PBK/TOPK的诊断阈值≥66.68时,诊断肺腺癌性胸水的灵敏度可达100%,特异度为15.8%；当PBK/TOPK的诊断阈值≥576.25时,诊断肺腺癌性胸水的特异度可达100%,灵敏度为5.36%；当胸水的PBK/TOPK诊断阈值>204.23时,诊断肺腺癌性胸水的灵敏度为83.7%,特异度为66.7%,准确度为76.6%,标准化准确度为75.2%,标准化阳性预告值为71.5%,标准化阴性预告值为80.4%。3、ELISA法检测49例肺腺癌和36例结核性胸水患者中的TTF-1的表达,结果显示肺腺癌性胸水和结核性胸水中均存在蛋白TTF-1的表达,其中肺腺癌性胸水中TTF-1的表达（955.43±915.74pg/m1）明显高于结核性胸水（267.22±257.05pg/m1）,差异有统计学意义（P=0.000）。应用ROC曲线分析TTF-1对于腺癌性胸水的诊断试验,得到当TTF-1≥55.83pg/ml时,诊断肺腺癌性胸水的灵敏度可达100%,特异度为41.7%；当TTF-1≥1097.53pg/ml时,诊断肺腺癌性胸水的特异度可达100%,灵敏度为72.5%；当TTF-1>289.88pg/ml时,此时Youden指数最大,诊断原发性肺腺癌性胸水的的灵敏度为91.8%,特异度为83.3%,准确度为88.2%,标准化准确度为87.55%,标准化阳性预告值为84.6%,标准化阴性预告值为91%。4、ELISA法检测了49例肺腺癌和36例结核性胸水患者中的SPA的表达,其中肺腺癌性胸水中SPA的蛋白浓度为139.58±39.18ng/ml,明显高于结核性胸水中SPA的蛋白浓度62.82±25.67ng/ml,差异具有显著性（P=0.000）。应用ROC曲线分析SPA的表达,进行诊断试验评价,得到当SPA的诊断阈值≥45ng/ml时,诊断肺腺癌性胸水的灵敏度可达100%,特异度为22.2%；当SPA的诊断阈值≥125.2ng/ml时,诊断肺腺癌性胸水的特异度可达100%,灵敏度为67.3%。当SPA>99.4ng/ml时,此时约登指数最大,诊断肺腺癌性胸水的灵敏度为89.8%,特异度为91.7%,准确度为90.6%,标准化准确度为90.75%,标准化阳性预告值为91.5%,标准化阴性预告值为90%。5、联合分析胸水中PBK、TTF-1、SPA三种蛋白的表达对于肺腺癌性和结核性胸水鉴别诊断价值的结果显示,最有鉴别诊断价值的组合为SPA+TTF-1,并且以其串联诊断试验的价值最高,诊断的灵敏度为82.4%,特异度为98.6%,标准化准确度为90.5%。四. PBK/TOPK、TTF-1、SPA的表达及其与胸水生化检查指标的联合诊断价值1、肺腺癌性胸水中的LDH、GLU的表达均高于结核性胸水,但前者差异具有统计学意义（P<0.05）,后者无统计学意义（P=0.393）。结核性胸水中的ADA、CRP的表达以及白细胞计数均高于原发性肺腺癌性胸水（P<0.05）。2、应用受试者工作特征曲线（ROC curve）分析LDH对于腺癌性胸水的诊断试验评价以及ADA、CRP、白细胞计数对于结核性胸水的诊断试验评价,得到曲线下面积分别为0.649（P=0.015）、0.936（P=0.000）、0.781（P=0.000）、0.640（P=0.022）,用以诊断肺腺癌性胸水的LDH的诊断阂值为243u/1,用于诊断结核性胸水的ADA、CRP以及白细胞计数的诊断阈值分别为16.95u/1、8.75mg/l、1500。以LDH>243u/l、ADA<16.95u/l、CRP<8.75mg/l、白细胞计数<1500作为鉴别诊断肺腺癌性胸水和结核性胸水的指标临界值,灵敏度分别为83.9%、89.5%、78.9%以及52.6%,特异度分别为50%、82.1%、60.7%以及75%。3、PBK/TOPK联合ADA、CRP对于肺腺癌性胸水和结核性胸水的鉴别诊断试验结果表明,以PBK联合ADA组合指标的串联试验诊断价值最高,相应的灵敏度为74.9%,特异度为94%；TTF-1联合ADA、CRP对于肺腺癌性胸水和结核性胸水的鉴别诊断试验结果表明,以TTF-1联合ADA组合指标的串联试验诊断价值最高,相应的灵敏度为82.2%,特异度为97%；SPA联合ADA、CRP对于肺腺癌性胸水和结核性胸水的鉴别诊断试验结果表明,以SPA联合ADA的指标组合的诊断价值最高,其中并联试验的灵敏度为98.9%,特异度为75.3%,标准化准确度为87.1%；串联试验的灵敏度为80.4%,特异度为98.5%,标准化准确度为89.5%。4、在PBK、TTF-1、SPA分别联合胸水生化指标ADA和CRP用于鉴别肺腺癌性胸水和结核性胸水的诊断试验中,以PBK+ADA、TTF-1+ADA、SPA+ADA的诊断价值较高,其中SPA+ADA的鉴别诊断价值最高,诊断的灵敏度为80.4%,特异度为98.5%,标准化准确度为89.5%。结论一、人肺腺癌细胞株A549、GLC-82形态结构差异明显,免疫表型存在一定的相似性和显著的差异性,两株细胞SPA、TTF-1均无表达,Ki67、CK7、CK8.PBK、P53均呈阳性,但程度不同,利用这些程度上的差异可对两株细胞进行鉴别。二、肺腺癌性胸水和结核性胸水中均存在PBK/TOPK、TTF-1、SPA蛋白的表达,肺腺癌胸水中PBK/TOPK、TTF-1、SPA的表达明显高于结核性胸水。基于ROC曲线方法得到PBK/TOPK作为鉴别肺腺癌性胸水与结核性胸水的诊断阈值分别为66.68、204.23、576.25,相应的灵敏度分别为100%、83.7%、5.36%,特异度分别为15.8%、66.7%、100%,准确度分别为66%、76.6%、43.8%；以TTF-1作为鉴别肺腺癌性胸水与结核性胸水的诊断阈值分别为55.83pg/ml、289.88pg/ml、1097.53pg/ml,相应的灵敏度分别为100%、91.8%、72.5%,特异度分别为41.7%、83.3%、100%,准确度分别为75.3%、88.2%、84.7%；SPA作为鉴别肺腺癌性胸水与结核性胸水的诊断阈值分别为45ng/ml、99.4ng/ml、125.2ng/m1,相应的灵敏度分别为100%、89.8%、67.3%,特异度分别为41.7%、83.3%、100%,准确度分别为67.1%、90.6%、81.1%；在PBK、TTF-1、SPA三种指标的单一和联合检测诊断试验分析中,单一指标以SPA的鉴别诊断价值最大,组合以SPA+TTF-1的鉴别诊断价值最大,并且以其串联诊断试验的价值最高,相应的灵敏度为82.4%,特异度为98.6%,标准化准确度为89.5%。三、在PBK、TTF-1、SPA分别联合胸水生化指标ADA和CRP的肺腺癌性胸水和结核性胸水的鉴别诊断试验中,以PBK+ADA、TTF-1+ADA、SPA+ADA的串联试验鉴别诊断价值较高,其中SPA+ADA的串联鉴别诊断价值最高。联合检测后进一步提高了常规胸水生化检查的灵敏度和特异度,对于临床应用有-定的指导意义和实践意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 研究思路
• 技术路线
• 参考文献
• 第一章 A549细胞和GLC-82细胞的鉴定及其形态结构、免疫表型的定量分析
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 参考文献
• 第二章 人肺腺癌细胞A549和GLC-82中PBK/TOPK、TTF-1、SPA的表达及定量分析
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 参考文献
• 第三章 肺腺癌性胸水和结核性胸水中PBK/TOPK、TTF-1、SPA的表达及诊鉴意义分析
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 参考文献
• 第四章 肺腺癌及结核性胸水中PBK/TOPK、TTF-1、SPA的表达与生化检查指标的相关性分析及联合诊断试验评价
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 附录
• 硕士期间发表论文
• 致谢
• 统计审稿证明