产1，3-丙二醇克雷伯氏杆菌的基因工程改造

论文摘要

1,3-丙二醇（1,3-PD）是国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-PD的生产方法有化学合成法和生物转化法。生物转化法生产1,3-PD具有显著的优点,成为当前的研究热点。为便于研究,首先确立了在克雷伯氏杆菌和大肠杆菌两个体系中,甘油脱水酶（GDHt）、1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）及其同工酶（YQHD）的酶活测量方法。确定了在缓冲溶液中加入2 mmol/L的二硫苏糖醇DTT可以明显提高甘油脱水酶,1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶的测量准确度。实验结果表明在功率300 w时,克雷伯氏杆菌和重组大肠杆菌JM109 （pHsh-dhaB-yqhD）能较好保持关键酶酶活的破碎条件均为:总超声破碎时间5 min,每隔4 s破碎1 s;酶活较适宜的测量条件为:GDHt酶活测定所用磷酸盐缓冲液的较适宜浓度为0.045 mol/L,来自克雷伯氏杆菌和大肠杆菌JM109 （pHsh-dhaB-yqhD）的GDHt最适宜pH分别为7.2和7; PDOR和YQHD测定所用碳酸盐缓冲液的较适浓度为0.1 mol/L,来自克雷伯氏杆菌的PDOR和大肠杆菌JM109 （pHsh-dhaB-yqhD）的YQHD较适宜pH分别为7.2、9;GDHt和PDOR,YQHD酶活测定的适宜温度分别为37℃、45℃、45℃。由于克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）1,3-PD合成途径中,加强甘油脱水酶基因表达,会导致因NADH供应不足使3-羟基丙醛累积,并对菌体生长及1,3-PD合成造成负面影响。为改善Klebsiella pneumoniae 1,3-PD合成途径,利用PCR技术从大肠杆菌（Escherichia coli）中扩增出以NADPH为辅酶的1,3-PD氧化还原酶同工酶基因yqhD,从克雷伯氏杆菌中扩增出GDHt基因dhaB,构建了产1,3-PD关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD,并将其转入到野生Klebsiella pneumoniae中。全细胞蛋白电泳分析显示Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）中GDHt和PDOR（YQHD）的蛋白表达量分别比野生Klebsiella pneumoniae高25.2%和17.4%,酶活则分别由0.59 U·mg-1和19 U·mg-1提高到1.02 U·mg-1和32 U·mg-1,蛋白含量和酶活的大幅提升,证明dhaB和yqhD在Klebsiella pneumoniae中得到了表达。通过抗生素浓度梯度实验,确定了Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）进行种子培养和发酵时培养基所含硫酸卡那霉素的最低浓度为30 mg/L,获得Klebsiella pneumoniae和Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）在种子培养基和发酵培养基中的生长曲线。摇瓶发酵结果显示,Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）比野生Klebsiella pneumoniae的乙醇含量略有提高,提高幅度为9.5%,乙酸含量下降了26.5%,而丁二醇含量更是下降了34.0%,主产物1,3-PD提高了25%。乙酸,乙醇和1,3-PD均在反应进行7 h左右开始大量生成,而丁二醇则要在第20 h左右才开始大量生成。进一步在5 L发酵罐上进行发酵试验,结果表明发酵培养较适宜的搅拌转速和通气量采用两段控制,第一阶段转速控制为200 r/min,通空气条件为2.0 vvm,7h后转速和通气量分别降为100 r/min和1.0 vvm。控制pH恒为7.0对重组Klebsiella pneumoniae（pEtac-dhaB-tac-yqhD）的发酵有利。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 1,3-丙二醇的性质，生产方法及应用领域
• 1.1.1 1,3-丙二醇的理化性质
• 1.1.2 1,3-丙二醇的主要用途
• 1.1.3 1,3-丙二醇的生产情况和主要生产方法
• 1.1.4 1,3-丙二醇的生产菌株及其合成路径
• 1.2 甘油合成1,3-丙二醇的关键酶
• 1.2.1 甘油脱水酶的结构及性质
• 1.2.2 1,3-丙二醇氧化还原酶的结构及性质
• 1.2.3 1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的结构及性质
• 1.3 产1,3-丙二醇基因工程的研究进展
• 1.4 微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究进展
• 1.4.1 培养基优化
• 1.4.2 培养条件
• 1.4.3 培养方式
• 1.5 氧化还原酶催化过程中辅酶作用
• 1.6 课题背景及意义
• 1.6.1 课题背景
• 1.6.2 课题意义
• 1.6.3 本课题研究内容
• 第二章 产1,3-丙二醇关键酶的酶活分析方法研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 培养方法
• 2.1.4 酶活测定方法
• 2.1.5 蛋白质含量测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 GDHt，PDOR 和YQHD 在细胞的内外分布
• 2.2.2 二硫苏糖醇对酶活保持的影响
• 2.2.3 破碎频率对酶活测定的影响
• 2.2.4 1,3-丙二醇氧化还原酶酶活测定所用缓冲液的选择
• 2.2.5 缓冲液的浓度对甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶酶活测定的影响
• 2.2.6 缓冲液的pH 值对甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶酶活测定的影响
• 2.2.7 温度对甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶酶活的影响
• 2.3 本章小结
• 第三章 重组克雷伯式杆菌（KLEBSIELLA PNEUMONIAE （PETAC-DHAB-TAC-YQHD）） 的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 工具酶与试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 PCR 引物
• 3.1.5 PCR 扩增反应体系及反应条件
• 3.1.6 PCR 产物胶回收
• 3.1.7 质粒DNA 的提取
• 3.1.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.9 转化大肠杆菌
• 3.1.10 克雷伯氏杆菌感受态细胞的制备以及转化
• 3.1.11 提高抗生素浓度筛选高产转化子
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 重组质粒pEtac-dhaB-tac-yqhD 的构建
• 3.2.2 重组克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD））的构建与高产1,3-PDO 重组子的筛选
• 3.2.3 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 3.2.4 酶活测定结果
• 3.2.5 讨论
• 3.3 本章小结
• 第四章 重组克雷伯氏杆菌（KLEBSIELLA PNEUMONIAE （PETAC-DHAB-TAC-YQHD））的发酵特性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 培养方法
• 4.1.4 抗生素浓度梯度实验
• 4.1.5 野生Klebsiella pneumoniae和重组Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）生长曲线的绘制
• 4.1.6 分析方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 抗生素浓度梯度实验
• 4.2.2 野生Klebsiella pneumoniae和重组Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）生长曲线的获得
• 4.2.3 摇瓶发酵结果
• 4.2.4 发酵过程中各种产物的含量变化
• 4.2.5 自动发酵罐发酵实验
• 4.3 本章小结
• 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文