益生菌Lactobacillus casei Zhang高密度培养技术及发酵过程中关键酶基因表达变化的研究

论文摘要

Lactobacillus casei Zhang是从中国内蒙古地区传统酸马奶中分离的一株具有良好益生特性的新生益生菌。因为益生菌产品中高浓度的活性菌体细胞是其发挥功效的必要条件,所以本研究针对L. casei Zhang的高密度培养技术展开研究,同时采用实时定量PCR技术从转录水平上研究了发酵过程中不同培养条件和不同生长阶段对菌体的影响。研究了不同碳源、氮源、碳氮比例、微量元素及缓冲盐对L. casei Zhang增殖培养的效果,并采用响应面法对优选的碳源、氮源和缓冲盐类的组成含量进行优化,得到L. casei Zhang的增殖培养基为:葡萄糖20.9g/L、大豆蛋白胨10.4g/L、酵母粉10.4 g/L、K2HPO43.5 g/L、醋酸钠14.6 g/L、柠檬酸钠2.3 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、MnSO4·5H2O 54mg/L、CuSO4·5H2O 10mg/L、吐温80 1g/L。通过对温度,初始pH、摇床转速等条件的研究得到菌体在此培养基中适宜的试管培养条件为:初始pH6.5,37℃,保温静止发酵。经18～20h培养后,L. casei Zhang活菌数可达到4.78×109 CFU/mL,比在MRS中(4.8×108 CFU/mL)提高近10倍。在优化增殖培养基的基础上,研究了不同中和剂、缓冲盐浓度、葡萄糖浓度、pH值控制、通气条件和接种量对菌体在恒pH条件下发酵的影响情况,根据不同条件下菌体的比生长速率、菌体密度和活菌数情况,确定L. casei Zhang较适宜的高密度培养条件为:培养基葡萄糖浓度为80 g/L,以氨水为中和剂使pH保持5.9,采用间歇通氮气的方法保持环境厌氧,接种量7%以分批培养方式下37℃保温发酵,10～12h后,L. casei Zhang细胞干重达到7.45 g/L,活菌数3.68×1010 CFU/mL,较优化前提高7倍以上。分别在不同pH和不同乳酸浓度条件下接种L. casei Zhang进行培养结果表明乳酸和低pH都抑制菌体生长并且两者有协同作用。不控制pH条件下,乳酸浓度20 g/L(pH4.0)就足以抑止菌体的生长,如果添加中和剂保持pH6则乳酸达到120 g/L才完全抑止菌体的生长根据发酵过程中菌体生长和代谢曲线变化规律,采用Origin7.5软件非线性拟合建立L. casei Zhang的生长、葡萄糖代谢和产乳酸的动力学模型,模型与试验值拟合良好,平均误差小于10%,能够真实地反应发酵过程。分别以100 mL/h和200 mL/L补料速度流加新鲜培养基研究了补料分批培养,结果表明100 mL/h补料分批培养与分批培养结果无差异,200 mL/h补料在发酵8h时出现稀释效应。在L. casei Zhang高密度培养小试基础上,进行50 L(有效工作容积30 L)到200 L(有效工作容积150 L)逐级放大中试生产工艺验证。200 L规模发酵罐发酵菌体密度可达2.9×1010 CFU/mL,与小试水平无差异。证明本研究所得到的L. casei zhang高密度培养技术切实可行,能够实现工业化生产。初步探讨发酵后菌体的离心和冷冻干燥过程对菌体的影响,虽然发酵液经离心收集菌体并冷冻干燥可得到平均活菌数2.65×1011 CFU/g的菌粉,能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求,但冻干前后活菌得率仅49.97%。有必要针对L. casei Zhang的冻干保护剂和冻干工艺进一步优化,以提高菌体存活率得到更高菌体浓度的益生菌粉。研究了不同培养条件下,gapd、gyrB、ldh、16s rRNA和recA 5个常用管家基因的表达情况,并应用GeNorm软件分析了管家基因的稳定性,结果表明5个管家基因在本试验所研究条件下表现都比较稳定,尤以gapd和gyrB最稳定,可以作为实时定量PCR的内参。采用荧光实时定量PCR技术研究了pH、乳酸浓度、通气条件和生长阶段的变化对L. casei Zhang一些关键酶基因(涉及葡萄糖转运、糖酵解和分子伴侣蛋白等方面的13个基因)表达变化的影响,结果表明不同培养条件对不同基因表达的影响程度不一,从转录水平描述了各种不同的发酵条件对菌体生长代谢的影响,为后续深入研究该菌生长代谢的分子机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 益生菌概述
• 1.1.1 益生菌的由来
• 1.1.2 益生菌的特征
• 1.1.3 益生菌的种类
• 1.1.4 益生菌的功能
• 1.1.5 益生菌的应用
• 1.2 Lactobacillus casei Zhang 的研究基础
• 1.2.1 L. casei Zhang 的来源及理化特性
• 1.2.2 L. casei Zhang 的益生特性
• 1.2.3 L. casei Zhang 的结构基因组学和功能基因组学的研究
• 1.3 高密度培养概述
• 1.3.1 高密度培养技术的定义和起源
• 1.3.2 高密度培养的理论基础
• 1.3.3 高密度培养技术研究现状
• 1.4 乳酸菌高密度培养的特点及国内外研究现状
• 1.4.1 乳酸菌高密度培养技术的特点
• 1.4.2 乳酸菌高密度培养国内外研究现状
• 1.5 实时定量PCR 技术及其在乳酸菌研究领域的应用
• 1.5.1 实时定量PCR 技术原理
• 1.5.2 实时定量PCR 定量mRNA 表达的方法
• 1.5.3 实时定量PCR 技术在乳酸菌研究中的应用
• 1.6 课题研究的目的意义和研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株来源
• 2.2 菌株的保存与活化
• 2.3 增殖培养基的优化
• 2.3.1 接种发酵工艺
• 2.3.2 培养基碳源和氮源的筛选
• 2.3.3 培养基碳氮量及碳氮比的优化
• 2.3.4 培养基微量元素及增殖因子的优化
• 2.3.5 培养基缓冲体系的优化
• 2.3.6 培养基组分构成比例的优化
• 2.4 试管培养条件的优化
• 2.5 搅拌发酵罐高密度培养的研究
• 2.5.1 搅拌发酵罐接种与发酵工艺
• 2.5.2 分批培养条件的优化
• 2.6 L.casei Zhang 发酵动力学分析
• 2.7 低pH 和乳酸对菌体生长抑制的研究
• 2.7.1 低pH 对菌体生长的影响
• 2.7.2 乳酸浓度对菌体生长的影响
• 2.8 补料分批培养模式的研究
• 2.9 高密度培养扩大中试
• 2.9.1 中试发酵设备
• 2.9.2 中试发酵工艺条件
• 2.10 发酵过程的各项监控指标及检测方法
• 2.10.1 菌体生长情况监控
• 2.10.2 菌体代谢监控
• 2.10.3 菌体产酸活力
• 2.10.4 水份含量的测定
• 2.10.5 杂菌、致病菌、霉菌的检验
• 2.11 高密度培养过程中关键酶基因的荧光定量PCR
• 2.11.1 发酵条件及样品的采集
• 2.11.2 目的基因及管家基因
• 2.11.3 引物设计及合成
• 2.11.4 RNA 提取及cDNA 合成
• 2.11.5 荧光 PCR
• 2.11.6 荧光定量PCR 数据处理分析
• 2.12 实验数据统计软件及方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 增殖培养基优化
• 3.1.1 培养基碳源、氮源的优化
• 3.1.2 L.casei Zhang 培养基碳氮量及碳氮比的优化
• 3.1.3 培养基微量元素的优化
• 3.1.4 培养基增殖因子
• 3.1.5 培养基缓冲盐的优化
• 3.1.6 正交旋转回归设计对培养基各组份的优化及验证
• 3.2 试管培养条件优化
• 3.3 搅拌型发酵罐高密度分批培养
• 3.3.1 中和剂的选择
• 3.3.2 培养基缓冲盐含量优化
• 3.3.3 不同pH 条件对菌体生长的影响
• 3.3.4 恒pH 培养条件下培养基葡萄糖浓度的优化
• 3.3.5 不同通气条件对菌体生长的影响
• 3.3.6 接种量对菌体生长的影响
• 3.4 L.casei Zhang 发酵动力学分析
• 3.4.1 生长动力学模型
• 3.4.2 底物消耗动力学
• 3.4.3 产酸发酵动力学
• 3.5 低pH 和乳酸浓度对菌体生长的抑制
• 3.5.1 低pH 对菌体生长的影响
• 3.5.2 乳酸浓度对菌体生长的影响
• 3.6 补料分批培养模式的研究
• 3.7 高密度培养中试工艺的研究
• 3.7.1 中试高密度培养工艺条件的确定
• 3.7.2 高密度培养终点的确定
• 3.7.3 菌体收集和冷冻干燥对菌体得率及产酸活力的影响
• 3.8 发酵过程中关键酶基因表达变化
• 3.8.1 RNA 的数量和质量
• 3.8.2 标准曲线和PCR 扩增效率分析
• 3.8.3 表达稳定的管家基因的选择
• 3.8.4 发酵过程中关键酶基因表达变化分析
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介