论文摘要
口腔颌面-头颈癌是世界范围内第六大常见癌症,其中口腔颌面部鳞状细胞癌占80%以上。随着医学科学技术的发展及各种治疗方式的推广,肿瘤的局部控制率有了明显的提高,但是,近20年来,口腔癌患者的5年生存率仍然维持在50%-55%,并无明显改善。随着肿瘤分子生物学研究的发展,揭示了恶性肿瘤的发生与多种癌基因激活、抑癌基因失活和细胞凋亡的调节紊乱有着密切关系,癌基因的激活和抑癌基因的失活参与了癌症发生发展过程的不同阶段。目前对恶性肿瘤的病因、诊断、治疗和预后的研究越来越受到人们的重视。尤其是在研究恶性肿瘤的发生及发展方面更是众多学者研究探讨的热点和难点。在口腔癌中,90%是鳞状细胞癌,其中舌部鳞状细胞癌的发病率最高。舌鳞癌的发生与发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程。之所以发病率较高而治愈率较低,主要原因是由于口腔癌的浸润及局部转移。口腔癌的浸润力如此之强,现在尚不能解释清楚。虽然众多学者提出各种肿瘤发生发展学说,但是确切的分子生物学机制仍不明了,肿瘤细胞如何获得浸润的能力,又是如何穿透基底膜进入血管和淋巴管从而达到局部转移也需要多年的努力才能揭开其神秘的面纱。恶性肿瘤的发生、发展及转移机制虽尚不清楚,但是目前已知,基质金属蛋白酶类（MMPs）及其抑制剂（TIMPs）、各种细胞因子及生长因子可以调节癌细胞的运动。基质金属蛋白酶（MMPs）是一个大家族,因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名,其家族成员具有相似的结构,一般由5个功能不同的结构域组成：（1）疏水信号肽序列;（2）前肽区;（3）催化活性区;（4）富含脯氨酸的铰链区;（5）羧基末端区。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。各种MMP间具有一定的底物特异性,但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份,而某一种细胞外基质成份又可被多种MMP降解,但不同酶的降解效率可不同。MMPs几乎能降解细胞外基质（ECM）中的各种蛋白成份,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤浸润及局部转移中起关键性作用,从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视,以至于MMPs被认为是肿瘤浸润转移过程中主要的蛋白水解酶。MMPs的抑制剂可分为天然抑制剂和人工化学合成抑制剂两大类;天然抑制剂有金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of metallo proteinases, TIMP）和α2巨球蛋白（α2macroglobulin）,其中前者研究较多。人工化学合成的抑制剂因其可批量生产并有较好的抑制肿瘤浸润和转移作用而成为目前的抗癌药物研究的一个新热点。所有MMPs的家族成员均可被一组基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）所抑制。在机体内活化的MMPs和TIMPs之间存在一种相对平衡关系,正是这种平衡关系决定了MMPs的活性。一旦改变了这种平衡关系,就将影响细胞间的浸润能力以及肿瘤的转移。基质金属蛋白酶及其抑制剂在口腔舌鳞癌中的研究国内外文献报道较少,本实验希望通过研究MMP-3、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2的mRNA在大鼠舌鳞癌转变过程中的转录水平表达、相关关系及意义,能够对口腔舌鳞癌的发生、发展提供新的资料和线索,进而对口腔舌鳞癌的预防、诊断和治疗提供帮助。第一部分MMP-3和MMP-13的mRNA在大鼠舌鳞癌转变过程中的表达及意义目的了解MMP-3和MMP-13的mRNA在大鼠舌鳞癌转变过程模型中的表达,推测两种基质金属蛋白酶在舌鳞癌中所起作用,及其对临床的诊断意义。方法1.建立SD大鼠舌鳞癌转变过程的模型SD大鼠50只随机分成三组,饲养在无特定病原体（specific pathogen free,SPF）动物房,恒温（20-26℃）、恒湿（45%-50%）的洁净环境内。精制饲料喂养,24小时光暗循环条件下饲养。正常对照组喂普通自来水,实验组喂4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）。2.标本制作16周和24周时分别处死大鼠,取大鼠舌部组织,分为两部分,一部分用4%多聚甲醛固定,行石蜡包埋,另一部分迅速冰冻于-80℃冰箱内待测。3.对石蜡包埋组织切片行HE染色,观察正常对照组舌部组织病理特点并观察实验组舌部组织为上皮异常增生和舌鳞癌的病理变化。4.冰冻于冰箱内的舌部组织用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法检测三组基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）的mRNA相对表达量。5.把正常组、上皮异常增生组和舌鳞癌组的基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）的mRNA相对表达量进行三组间的相互比较。6.采用2-△△ct计算目的基因的相对表达量,应用SPSS 13.0软件进行统计并分析。舌鳞癌组、上皮异常增生组和正常组三者之间比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）。结果1. SD大鼠舌鳞癌转变模型建立后的上皮异常增生组HE染色结果显微镜下显示上皮基底细胞极性消失,核浆比例增加,上皮钉突呈滴状,上皮层次紊乱,有丝分裂相增加,细胞多形性,细胞核浓染,核仁增大,在棘细胞层中单个或成团细胞角化。舌鳞癌组瘤细胞排列疏松,间质较少,癌细胞呈大小不均的圆形,核浆比例大,异型性明显,核椭圆形、圆形、大小不等,核染色深,核分裂相多见,染色质较粗、深染,核仁多个,说明大鼠舌鳞癌转变过程模型建立成功。2.大鼠所取舌部组织荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果显示MMP-3、MMP-13的mRNA在舌鳞癌组表达显著,在上皮异常增生组表达有所增加,而在正常舌组织中只表现微弱的表达。MMP-3mRNA的相对表达量在舌鳞癌组相对最多,在上皮异常增生组较舌鳞癌组少,但与正常对照组相比增加明显。MMP-13的mRNA在正常对照组相对表达量较少,上皮异常增生组表达量比正常组显著增加,而在舌鳞癌组的相对表达量比前两组都高。3.统计结果显示MMP-3的mRNA表达舌鳞癌组与正常对照组比较有统计学意义,舌鳞癌组与上皮异常增生组比较有统计学意义,并且上皮异常增生组与正常对照组比较也有统计学意义。MMP-13的mRNA相对表达量显示舌鳞癌组与正常对照组比较有统计学意义,舌鳞癌组与上皮异常增生组比较有统计学意义,上皮异常增生组与正常对照组比较有统计学意义。第二部分TIMP-1和TIMP-2的mRNA在大鼠舌鳞癌转变在大鼠舌鳞癌转变过程中的表达及意义目的了解TIMP-1和TIMP-2的mRNA在大鼠舌鳞癌转变过程模型中的表达,推测两基质金属蛋白酶在舌鳞癌中所起作用,及其对临床的诊断意义。方法1.建立SD大鼠舌鳞癌转变过程的模型同第一章2.标本制作同第一章3.对石蜡包埋组织切片行HE染色,观察正常对照组舌部组织病理特点并观察实验组舌部组织为上皮异常增生和舌鳞癌的病理变化。4.冰冻于冰箱内的舌部组织用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的方法检测三组基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）的mRNA相对表达量。5.把正常组、上皮异常增生组和舌鳞癌组的基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）的mRNA相对表达量进行三组间的比较。6.采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量,应用SPSS 13.0软件进行统计并分析。舌鳞癌组、上皮异常增生组和正常组三者之间比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）。结果1.常规HE染色中：同第一章2.大鼠舌部组织荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果显示TIMP-1的mRNA表达在正常组较低,在上皮异常增生组有所增强,而在舌鳞癌组表达显著增强。TIMP-2的mRNA表达在上皮异常增生组中表达强度比正常舌组织较强,但舌鳞癌组与舌正常组相比显著增强。TIMP-1 mRNA的相对表达量从正常对照组到舌鳞癌组的变化过程中是呈显著增强的趋势,对于TIMP-2 mRNA的相对表达量从正常对照组到上皮异常增生组再到舌鳞癌组的变化也是呈逐渐增加的趋势。3.统计学结果显示TIMP-1和TIMP-2的mRNA的相对表达量均表现出正常对照组与上皮异常增生组比较有统计学意义,舌鳞癌组与正常对照组和上皮异常增生组分别比较均有统计学意义。第三部分MMP-3、MMP-13与TIMP-1、TIMP-2的mRNA在大鼠舌鳞癌转变过程中的相关关系及意义目的研究MMP-3、MMP-13与TIMP-1、TIMP-2的mRNA在大鼠舌鳞癌转变过程中的相关关系及对临床的诊断意义和运用价值。方法1.建立SD大鼠舌鳞癌转变过程的模型同前两章,建立过程同前2.标本制作同前两章3.对石蜡包埋组织切片行HE染色,验证组织病理变化。4.冰冻于冰箱内的舌部组织应用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的方法检测三组基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）的mRNA相对表达量,基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶组织抑制剂2 （TIMP-2）的mRNA相对表达量。5.采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量,应用双变量相关分析探讨MMP-3、MMP-13与TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达在大鼠舌鳞癌转变过程中的相关关系。结果动物模型、各组舌组织病理变化及荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）中各基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂的相对表达量同前两章。MMP-3与TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达之间成显著正相关;MMP-13与TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达成显著正相关。全文结论1. MMP-3与MMP-13的mRNA相对表达量在大鼠舌鳞癌转变过程中增加。2. TIMP-1与TIMP-2的mRNA相对表达量在大鼠舌鳞癌转变过程中增加3.MMP-3、MMP-13与TIMP-1、TIMP-2的mRNA相对表达在大鼠舌鳞癌转变过程中存在正相关关系。
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