棉花体细胞胚发生受体类激酶基因的克隆与功能分析

论文摘要

棉花是世界上重要的经济作物之一,而目前其经济价值主要体现在它的生殖器官中,因此,对棉花生殖器官发育的分子机理进行研究,如花器官发育、纤维发育,尤其是雄蕊的发育,对培育新的棉花品种、提高棉花产量与改善棉纤维品质具有重要意义,从而可推动我国棉花产业的快速发展。体细胞胚发生受体类激酶（Somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK）是膜富亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor-like kinases, LRR-RLKs）的亚家族,SERK具有典型的胞外信号受体结构域、疏水跨膜结构域以及胞内Ser/Thr激酶结构域,在体细胞胚发生、无融合生殖、孢子体发育以及植物响应生物和非生物胁迫等方面起着重要作用。本研究利用同源克隆的方法,在棉花基因组中克隆到两个不同的棉花（Gossypium hirsutum） SERK基因（GhSERK）片段,根据核苷酸分析,分别命名为GhSERK1和GhSERK4。同时,Southern Blot结果显示,在棉花基因组中至少存在2-3个SERK基因。已获得GhSERK1基因的全长序列,GhSERK1全长基因组序列为6920bp,其cDNA全长为2502bp（GenBank登录号: HQ621831.1）,其中5’UTR为424bp,CDS为1884bp,3’UTR为194bp。推断该基因编码627个氨基酸残基,蛋白分子量大约为69KD,等电点为5.55。GhSERK1蛋白的1-241氨基酸残基编码胞外结构域,242-264氨基酸残基编码跨膜结构域,265-627氨基酸残基编码胞内激酶结构域,其中在第28与29位氨基酸残基间存在一个信号肽切割位点,所以1-28个氨基酸残基编码一段信号肽序列。生物信息学分析该基因编码一个Thr/Ser激酶。核苷酸与蛋白质BLAST结果表明,GhSERK1基因包含11个外显子和10个内含子;外显子1编码信号肽（signal peptide, SP）;外显子2编码亮氨酸拉链结构（leu zipper, ZIP）;外显子36编码5个富亮氨酸重复序列（leu-rich repeat, LRR）,其中除外显子4编码LRR2和LRR3外,其他每一个外显子编码一个LRR;外显子7编码含SPP（Ser-Pro-Pro）基序的富脯氨酸结构域;外显子8编码跨膜结构域（transmembrane region, TM）;外显子911编码胞内激酶活性结构域。Southern Blot结果显示,GhSERK1基因在棉花基因组中为单拷贝。表达谱分析发现,GhSERK1基因在棉花整个生长发育过程以及各组织中均表达,但在不同组织中的表达量有差异:其在根、茎、叶和棉纤维等组织中呈微量表达;在生殖组织中随花蕾发育呈递增表达,同时在花药和胚珠中的表达量相对较高。此外,在花粉发育异常株系——胞质不育系P30A棉花中,其在小孢子败育阶段表达量明显低于正常可育系植株。这些结果表明GhSERK1基因可能在棉花生殖发育过程中,尤其是雄性生殖发育中发挥作用。为了进一步分析GhSERK1基因在棉花生长发育中的功能,本研究将分别含有GhSERK1基因的一个特异片段和两个同源片段的3个干扰载体转化棉花,并获得了转基因株系。根据荧光定量PCR结果发现,无论是转特异片段干扰载体的株系,还是转同源片段干扰载体的株系,与野生型相比,转基因株系中GhSERK1基因的表达量都减少了,其表达量仅为野生型的40%-1%不等;根据转基因植株的表型来看,它们的营养生长与野生型没有明显的差异,但雄蕊发育异常。其结果为:在转特异片段干扰载体的株系中,即只干扰GhSERK1基因本身,转基因植株除部分花药的花粉活力略有下降外,花药无明显差异;但在转SERK基因家族同源片段干扰载体的株系中,即干扰SERK基因家族中的多个基因,会影响花药的发育,出现花粉数量减少、花粉活力下降、部分花药有花粉但不开裂、甚至部分花药无花粉。这说明,棉花中的GhSERK1基因参与雄蕊发育,同时,推测棉花中SERK基因家族中可能不止一个成员参与了雄蕊发育,而且这些成员间有功能互补作用。本论文获得了棉花中的SERK基因,并对GhSERK1基因的功能进行了研究,结果表明GhSERK1基因在棉花雄性生殖发育中起作用,同时可能参与棉花中多个生长发育过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 棉花雄性生殖发育的研究进展
• 1.1.1 棉花花药结构简介
• 1.1.2 棉花花药发育的细胞学特征
• 1.1.3 棉花花药发育的分子机理
• 1.1.4 棉花雄性不育及其遗传研究
• 1.2 体细胞胚发生受体类激酶基因的研究进展
• 1.2.1 SERK 基因家族的发现
• 1.2.2 SERK 基因家族的基因及蛋白结构特征
• 1.2.3 SERK 基因的表达与调控
• 1.2.4 SERK 基因及其蛋白功能
• 1.2.5 展望
• 1.3 研究内容和意义
• 1.4 本文研究的策略和方法
• 1.4.1 研究策略
• 1.4.2 技术路线
• 第二章 棉花体细胞胚发生受体类激酶基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 棉花基因组BAC 文库
• 2.1.3 菌株及载体
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 引物及测序
• 2.2 方法
• 2.2.1 提取棉花基因组
• 2.2.2 同源克隆棉花SERK 基因家族
• 2.2.3 筛选棉花基因组BAC 文库（PCR 直选法筛选BAC 文库的原理）.
• 2.2.4 脉冲场电泳阳性BAC 质粒的酶切产物
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 棉花SERK 基因片段分析
• 2.3.2 SERK 基因阳性BAC 质粒的获得
• 2.4 小结
• 第三章 GhSERK1 的基因组、启动子和CDNA 序列的获得与生物信息学分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株及载体
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 引物及测序
• 3.2 方法
• 3.2.1 质粒DNA 的提取
• 3.2.2 单引物测序法获得GhSERK1 基因全长基因组序列
• 3.2.3 提取棉花RNA
• 3.2.4 3’和5’RACE 扩增GhSERK1 基因的cDNA 3’末端和5’末端
• 3.2.5 生物信息分析软件及网络资源
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 GhSERK1 基因的全长基因组序列
• 3.3.2 GhSERK1 基因的全长cDNA 序列
• 3.3.3 GhSERK1 的生物信息学分析
• 3.4 小结
• 第四章 GhSERK1 基因与GhSERK 基因家族的拷贝数分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 引物及测序
• 4.2 方法
• 4.2.1 提取棉花基因组
• 4.2.2 Southern Blot
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 GhSERK1 基因的拷贝数
• 4.3.2 棉花中SERK 基因家族的拷贝数
• 4.4 小结
• 第五章 GhSERK1 基因的表达谱分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 载体和菌株
• 5.2 方法
• 5.2.1 提取棉花RNA
• 5.2.2 cDNA 第一链的合成
• 5.2.3 RT-PCR 和Real-Time PCR.
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 GhSERK1 基因在棉花各组织与不同生长时期的表达情况
• 5.3.2 GhSERK1 基因在棉花不育系与可育系中生殖器官表达情况
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 转GhSERK1 基因干扰载体棉花的获得与分析
• 6.1 材料
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 菌株与载体
• 6.1.3 试剂
• 6.1.4 引物合成及测序
• 6.2 方法
• 6.2.1 提取棉花总RNA 及反转录PCR
• 6.2.2 PCR 扩增cDNA 干扰片段
• 6.2.3 入门载体的构建
• 6.2.4 植物稳定表达载体的构建
• 6.2.5 花粉管通道法转化棉花
• 6.2.6 农杆菌喷施法转化棉花
• 6.2.7 卡那霉素筛选以及PCR 法鉴定转基因植株
• 6.2.8 转基因植株表型观察
• 6.2.9 荧光定量PCR 分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 干扰载体的构建
• 6.3.2 转基因植株的筛选与获得
• 6.3.3 转基因植株表型观察
• 6.3.4 转基因植株荧光定量PCR 分析
• 6.3.5 转基因植株花粉活力观察
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历