对硝基苯酚高效降解菌的分离、鉴定及降解性能研究

论文摘要

硝基酚类物质是一类重要且常用的化工原料,作为原材料或中间体被广泛应用于炸药、医药、杀虫剂、染料、木材防腐剂和橡胶等生产中;硝基酚在生产和使用过程中,会随着工业废水的排放对环境造成污染,对硝基苯酚（p-Nitrophenol,PNP）是化工、印染、医药和炸药等行业的重要原料之一,而且也是有机磷农药,如甲基对硫磷（Methyl Parathion,MP）的中间代谢产物,是一类较为普遍的环境污染物质。进入环境的PNP会长期残留在土壤和水中,对动植物和人类健康产生威胁。许多学者都致力于研究对硝基苯酚的生物降解,但研究只是处于筛选到的微生物只能够降解低浓度的对硝基苯酚,降解过程中产生的亚硝酸盐很难除去,也有学者利用构建基因组文库的方法克隆到了能够降解对硝基苯酚的基因簇。本研究利用富集培养法,从华阳农药厂污水处理池的活性污泥中筛选并获得多株能够高效降解PNP的细菌菌株,其中菌株Y1具有较好的降解性能;并对Y1的降解特性、降解机理及降解酶基因进行了研究,研究内容如下:1.从华阳农药厂污水处理池的活性污泥中筛选了多株能够高效降解PNP的细菌菌株,从中筛选到一株降解性能较好的菌株,将其命名为Y1,通过形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析,将其鉴定为节杆菌属（Arthrobacter sp. Y1）;其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号是EU282772。2.纯培养的条件下,运用紫外分光光度计法（UV-Vis）和高效液相色谱（HPLC）法,测定了菌株Y1对PNP的降解性能。在pH 7和30℃条件下,Y1能够将50 mg/L的PNP在6 h内完全降解,同时测定了不同接种量、外加碳源、温度、pH及PNP浓度对菌株降解能力和菌体生长的影响,结果表明:在以PNP为唯一碳源存在的条件下,接种量0.10～0.3 g/L、温度15～40℃、pH 6～11、PNP浓度在100400 mg/L的条件下,菌株的降解效果较好;菌株能够耐受PNP的浓度为600 mg/L,在外加碳源（0～30 g/L）存在的条件下,能够促进菌株对PNP的降解,如果外加碳源浓度过高（30～50 g/L）,菌体对PNP的降解会受到抑制。3.通过HPLC和UV-Vis测定表明,4-硝基儿茶酚（4-NC）是主要的代谢产物,随着降解的进行,4-NC逐渐被降解,最终转化为二氧化碳和水;Y1能够在以4-NC为唯一碳源和氮源的培养基中生长,表明菌株对PNP的降解主要是以4-NC途径进行,4-NC途径也是革兰氏阳性菌降解PNP的典型途径。4.研究了经PNP诱导的培养物的上清液对PNP的降解,结果发现:在不接菌的条件下,上清液能够降解PNP为二氧化碳和水,结果表明降解酶是一种胞外酶。5.由于菌体是通过4-NC途径对PNP进行降解,根据已注册的能够通过4-NC途径降解PNP的基因簇设计两组特异性引物,分别进行PCR扩增,其中一组引物经PCR扩增后得到一条大约1.5 kb的条带,对这个条带进行测序分析,发现它与已知编码双加氧酶的氧化酶组分同源,而且经过功能分析表明,它能够将PNP转化为4-NC,该基因的注册号为EU282773。6.运用SDS-PAGE对诱导和非诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳分析表明,诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳出现了多条差异条带,推测降解酶是诱导型表达的;菌体粗酶液活性分析表明,诱导条件下和非诱导条件下菌体的粗酶液都能够快速将对硝基苯酚降解为无毒物质;诱导条件下粗酶液降解对硝基苯酚的速率是非诱导条件下的7.2倍,说明降解酶在诱导条件下可以迅速降解对硝基苯酚,但是在非诱导条件下,降解酶可以组成型表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 1 前言
• 1.1 硝基酚类物质研究进展
• 1.1.1 硝基酚类物质概述
• 1.1.2 具有降解硝基酚能力的微生物
• 1.2 对硝基苯酚降解研究现状
• 1.2.1 对硝基苯酚概述
• 1.2.2 对硝基苯酚降解菌及代谢方式
• 1.2.3 对硝基苯酚生物降解途径
• 1.2.4 对硝基苯酚降解基因的研究
• 1.2.5 对硝基苯酚降解酶的研究
• 1.2.6 存在的问题
• 1.3 关于菌株对污染物降解的残留及其产物的遗传毒性分 析
• 1.3.1 Umu 概述
• 1.3.1.1 Umu 的概念
• 1.3.1.2 SOS 反应
• 1.3.2 SOS/umu 实验（经典umu 实验）
• 1.3.2.1 实验原理
• 1.3.2.2 常用实验菌株
• 1.3.2.3 umu 实验方法在环境科学中的应用
• 1.4 本研究的内容、目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 药品试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 降解菌的富集驯化与筛选分离
• 2.2.1.1 降解菌的富集驯化
• 2.2.1.2 降解菌的筛选分离
• 2.2.2 降解菌的形态鉴定及系统发育分析
• 2.2.2.1 形态及生理生化鉴定
• 2.2.2.2 分子生物学鉴定
• 2.2.2.3 系统发育分析
• 2.2.3 降解菌的生长特性与降解性能
• 2.2.3.1 降解菌的生长曲线的测定
• 2.2.3.2 紫外分光光度法测定菌体对 PNP 的降解
• 2.2.3.3 色谱法测定菌体对 PNP 的降解
• 2.2.3.4 接种量、外加碳源、温度、pH 及 PNP 浓度对菌株降解能力和菌体 生长的影响
• 2.2.4 降解中间产物的检测
• 2.2.5 菌体培养液上清对 PNP 的降解
• 2.2.6 降解过程中亚硝酸盐的检测
• 2.2.7 遗传毒性分析
• 2.2.8 降解酶基因的定位与克隆
• 2.2.8.1 质粒的提取
• 2.2.8.2 质粒的消除
• 2.2.8.3 PNP 降解酶基因的克隆
• 2.2.8.4 表达载体 pET-npdA 的构建
• 2.2.9 PNP 降解酶特性研究
• 2.2.9.1 降解酶粗酶的提取
• 2.2.9.2 菌体全细胞蛋白质SDS-PAGE 和Native-PAGE 分析
• 2.2.9.3 胶板的制备方法
• 2.2.9.4 样品处理
• 2.2.9.5 凝胶的染色与脱色
• 2.2.9.6 降解酶对PNP 的降解特性
• 3 结果与分析
• 3.1 PNP 降解菌的分离鉴定
• 3.1.1 菌株的形态学观察
• 3.1.2 菌株的生理生化特性
• 3.1.3 菌株的16SrDNA 系统发育分析
• 3.2 菌株的生长特性及降解性能分析
• 3.2.1 菌株对 PNP 的降解性能测定
• 3.2.1.1 分光光度法测定菌株对 PNP 的降解
• 3.2.1.2 高效液相色谱法测定菌株的降解性能
• 3.2.2 菌株对 PNP 耐受浓度的测定
• 3.2.3 初始 PNP 浓度、接种量、外加碳源、培养温度和 pH 对 PNP降解的影响
• 3.2.4 经 PNP 诱导培养物的上清液对 PNP 的降解
• 3.2.5 紫外分光光度计法检测亚硝酸盐的产生
• 3.2.6 对 PNP 降解的遗传毒性分析
• 3.3 降解菌底物谱的测定
• 3.4 对硝基苯酚降解基因的定位与克隆
• 3.4.1 对硝基苯酚降解基因的定位
• 3.4.2 对硝基苯酚降解基因的克隆
• 3.5 工程菌的构建及工程菌对 PNP 的降解性能测定
• 3.5.1 工程菌的构建
• 3.5.2 工程菌对 PNP 的降解性能测定
• 3.6 对硝基苯酚降解酶特性研究
• 3.6.1 降解酶表达特性
• 3.6.2 粗酶液的降解性能
• 4 讨论
• 4.1 PNP 降解微生物
• 4.2 对硝基苯酚的微生物降解途径
• 4.3 对硝基苯酚降解酶基因的克隆
• 4.4 对硝基苯酚降解酶的分离纯化
• 4.5 下一步工作设想
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间完成论文