土壤放线菌的筛选、鉴定及其活性代谢产物的研究

论文摘要

放线菌由于其产生抗生素、酶及其抑制剂等有用生物活性物质,具有巨大经济价值,至今发现的两万种生物活性物质中,约70%是由放线菌产生的。而土壤又是放线菌含量最丰富的地方,因此开发土壤放线菌具有十分重要的意义。本研究旨在土壤中分离出对多种植物病原真菌具有强烈拮抗作用的放线菌,对菌株进行鉴定,并对其抑菌活性物质进行分离,寻找新型农用抗生素的产生菌来源,具体研究内容如下:（1）放线菌的分离。对来自黑龙江省、湖北省、山东省、贵州省、河北省五个省份的九份土样进行自然干燥等预处理后,采用选择性分离培养基腐殖酸培养基加50μg/mL的重铬酸钾进行放线菌的选择性分离。共分离得到101株放线菌。（2）高活性菌株的筛选。采用管碟法测定了101株放线菌发酵液对细菌的抑菌活性,其中有31株放线菌对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌圈直径≥15 mm,其中W2、W13、B5、Q5、Q10这5株放线菌的抑菌圈直径都在20 mm以上。（3）放线菌的分类学研究。结合经典分类和分子生物学中16SrRNA分类,对W2、W13、Q1、Q2、Q7这5株放线菌的分类研究表明:其形态特征、培养特征、生理生化特征均与链霉菌属一致;其中W2号放线菌同链霉菌Streptomyces neyagawaensis ATCC 27449的相似性达到99 %;Q1号放线菌同链霉菌Streptomyces corchorusii 088-68-1的相似性达到99 %;Q2号放线菌同链霉菌Streptomyces lavendulae ZGO429的相似性达到99 %;Q7号放线菌同链霉菌Streptomyces sp. VTT E-99-1333 （B306）的相似性达到99 %;W13号放线菌同链霉菌Streptomyces thermocarboxydus AT37的相似性达到99 %。进一步确定这5株放线菌均属于链霉菌属（Streptomyces）。（4）发酵粗提物对真菌的抑制研究。对细菌有较好抑菌活性的W2、W13、B5、Q5、Q10这5株放线菌发酵粗提物,进行了对9种致病真菌的抑菌活性研究,结果表明,其发酵粗提物至少对4种真菌有抑菌作用,对6种以上真菌有抑制作用的菌株有2株,分别为W2和Q5,其中W2菌株对7种真菌都有抑菌作用,并且抑制率都在50%以上。（5）发酵粗提物的分离。将这5株放线菌的发酵粗提物进行了分离、纯化及结构鉴定。结果显示,从W2中分离出了2种化合物,其中化合物7-prenylindole具有抑制真菌的作用,化合物borrelidin具有抗癌,抑菌,除草活性等多种用途;从W13中分离出了1种新的化合物;从B5中分离出了2种化合物conglobatin和anastrien B;从Q5中分离出1种化合物;从Q10中分离出2种化合物（6）化合物的活性验证。进行了化合物7-prenylindole和borrelidin的抑真菌活性测定,结果表明:化合物7-prenylindole在浓度为100μg/mL时,对6种致病真菌都有抑制活性。borrelidin在浓度为100μg/mL对5种致病真菌都具有很强的抑制真菌活性。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 农用抗生素的研究进展
• 1.1.1 农用抗生素的定义和优点
• 1.1.2 农用抗生素的发展动态
• 1.1.3 农用抗生素的产生菌
• 1.2 放线菌的研究概况
• 1.2.1 放线菌的分类地位、特点
• 1.2.2 放线菌形态结构、生态分布
• 1.2.3 土壤放线菌的分离、筛选
• 1.2.4 放线菌分类的研究进展
• 1.3 课题来源、研究内容及意义
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 研究内容及意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 土壤样品
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 生物活性测定细菌
• 2.1.4 生物活性测定真菌
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 土样中放线菌的分离和纯化
• 2.2.2 生物活性测定
• 2.2.3 放线菌的分类鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 土壤中放线菌的分离结果
• 3.2 5 株放线菌菌株的分类鉴定
• 3.2.1 5株放线菌的形态特征
• 3.2.2 5株放线菌的培养特征
• 3.2.3 5株放线菌的生理生化特征
• 3.2.4 5株放线菌 16S rRNA 的鉴定
• 3.3 抑菌活性的测定
• 3.3.1 抑细菌活性的测定
• 3.3.2 抑真菌活性测定
• 3.4 活性物质的分离、纯化及结构鉴定
• 3.5 化合物的活性验证
• 4.讨论
• 4.1 放线菌选择性分离与纯化
• 4.2 放线菌的鉴定
• 4.3 菌种保存
• 4.4 关于菌株 W2 的开发前景
• 5.结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文