恒河猴骨髓间充质干细胞移植代替损伤的角膜内皮细胞的实验研究

论文摘要

目的:将体外培养的恒河猴骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植于角膜内皮表面,观察细胞形态及功能变化,以探讨骨髓间充质干细胞体内诱导为角膜内皮细胞并发挥其功能的可行性。方法:恒河猴4只分为实验组（3只）和对照组（1只）。采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养BMSCs,通过流式细胞仪检测细胞表面分子及对细胞进行脂肪细胞诱导等方法以鉴定体外培养的BMSCs,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）对培养的BMSCs进行标记,通过离心沉淀法将BMSCs移植于撕除后弹力层及角膜内皮层的恒河猴角膜植片内皮面并原位缝合于植床,术后观察角膜植片的透明度,于术后一月、二月、三月摘取术眼角膜植片进行病理切片、抗Brdu单克隆抗体免疫组化染色及电镜检查,观察移植细胞的分布情况、细胞之间的连接、形态变化以及细胞表面分子的变化。结果:密度梯度离心联合贴壁法可以获得较高纯度的BMSCs,体外培养24小时有少量细胞贴壁,48小时细胞贴壁率约5%,12～16天细胞90%汇合,细胞呈梭形,平行或漩涡状排列;CD29表达阳性率94.26%,CD45表达阳性率4.02%,CD34表达阳性率7.51%,培养的细胞通过脂肪细胞诱导液培养3周后,油红O染色细胞浆被染为橘红色,细胞核染为蓝色;术后实2周左右实验组及对照组角膜植片均水肿浑浊,术后7-8周后实验组角膜植片保持一定的透明性,而对照组角膜水肿严重,发生大泡性角膜病变;术后角膜植片扫描电镜显示:移植术后一月,移植的细胞散状分布于角膜植片内皮面,呈短梭形;术后二月,部分细胞连成片状,细胞呈梭形及多角形;术后三月,细胞较均匀生长于角膜植片内皮面,细胞呈多角形,细胞间相互连接较紧密;Brdu免疫组织化学染色可见角膜植片内皮表面细胞染色阳性,细胞核被染为褐色。结论:通过密度梯度离心联合贴壁法可以获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,BMSCs通过离心沉淀法移植到角膜内皮面后,在体内诱导为角膜内皮样细胞,并发挥一定的功能。

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