小豆蔻明靶向作用于mTOR抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

论文摘要

[研究背景及目的]胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病的共同病理生理基础,常引起中央或外周血管结构和功能的改变,导致血管张力的异常增加以及血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscular Cells,VSMCs）的异常增殖。因此,改善IR,逆转或抑制VSMCs增殖是防治血管增殖性疾病的重要措施。哺乳类雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target Of Rapamycin,mTOR）为胰岛素（Insulin,Ins）信号通路中的重要分子,参与基因转录、蛋白质起始翻译、核糖体生物合成及细胞增殖等多种生物学效应,是细胞生长过程中极为重要的靶标。研究表明,血管增殖性疾病、代谢综合症等诸多疾病的发生发展均与mTOR的表达及功能改变有关。常用的抗排斥药物雷帕霉素（Rapamycin,RAP）为mTOR特异性抑制剂,能够抑制VSMCs增殖,提示mTOR可能成为防治血管增殖性病变的重要靶标。然而,RAP主要用于抗移植排异,不良反应较多,限制全身性应用。中药资源丰富,基于mTOR筛选抑制抗增殖的中药有效成分的研究,国内外少见。因此,以mTOR为靶标改善IR所致血管病变的药物研发具有广阔前景。小豆蔻明（Cardamonin,Car）为豆蔻属植物中的查尔酮类单体,化学结构为2,4-双羟基-6’甲氧基查尔酮。研究显示,Car具有心血管保护作用,能明显舒张血管。目前,Car在IR状态下对VSMCs增殖影响的研究国内外少有报道。本研究以高糖高胰岛素模拟IR状态培养人脐动脉平滑肌细胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells,HUASMCs）,探讨Car对高糖高胰岛素诱导HUASMCs增殖的影响,通过检测mTOR及其结合蛋白Raptor、Rictor的mRNA表达,深入探讨Car抑制细胞增殖的作用机制,同时考察Car免疫抑制活性,为寻找改善IR、治疗血管增殖性病变的药物提供实验基础。[方法]1.细胞培养采用组织贴块法培养原代HUASMCs,传代细胞分別川含10%小牛血清的正常RPMI 1640培养基和高糖高胰岛素模拟IR培养基(含2.5 mol·L-1葡萄糖和100 U·L-1胰岛素的RPMI 1640培养基)在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。采用密度梯度离心法分离健康人外周血淋巴细胞。淋巴细胞用含10%小牛血清的正常RPMI 1640培养基,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。2.分组与给药HUASMCs按正常培养和模拟IR培养后,分别设细胞对照组、PD98059（?）3×10-5MOL·L-1)组、PD98059+LY294002(10-5mol·L-1)组、PD98059+LY294002+PA(10-4mol·L-1)组、RAP(10-7mol·L-1)组及Car(10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1、10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)组。人淋巴细胞按正常培养及PHA(5 mg·L-1)刺激培养后,设细胞对照组、PHA组、阳性药物RAP及CsA(10-7mol·L-1、10-5mol·L-1)对照组、Car(10-7mol·L-1、3×10-7mol·L-1、10-6mol·L-1、3×10-6mol·L-1、10-5mol·L-1、3×10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)组。3.测定指标经不同试药处理3 d,用不含细胞的培养基空白孔调零,MTT法（λ=490 nm）测定HUASMCs增殖。采用ELISA法测定人淋巴细胞分泌的IL-2水平。利用Trizol试剂,一步法提取HUASMCs总RNA,经Real-time PCR扩增mTOR、Raptor和Rictor,以β-actin作内参,采用Livak法计算mRNA表达量。[结果]1.高糖高胰岛素培养基较正常培养基明显促进HUASMCs的增殖（0.545±0.028 vs0.422±0.047,P＜0.01）。对于正常及模拟IR培养的HUASMCs,10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1Car对细胞增殖无影响,高剂量Car(10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)抑制细胞增殖（P＜0.01）。PD98059抑制HUASMCs增殖,RAP及Car(10-4mol·L-1)能加强该作用（P＜0.05,P＜0.01）。同时加入PD98059及LY294002,并进一步采用PA诱导HUASMCs增殖,该作用可被RAP及高低剂量Car(10-6mol·L-1、10-4mol·L-1)所阻断（P＜0.05,P＜0.01）,且高剂量Car作用较RAP对照更为显著（P＜0.01）。2.预先给予PD98059,RAP及Car(10-6mol·L-1、10-5mol·L-1)能明显降低正常培养及模拟IR状态下HUASMCs中mTOR mRNA的表达。RAP、Car(10-6mol·L-1、10-5mol·L-1)对正常培养的HUASMCs中Raptor mRNA的表达均具有抑制作用。对于模拟IR培养的HUASMCs,RAP、Car(10-5mol·L-1)则呈促进作用。在正常培养状态下,RAP对HUASMCs中Rictor mRNA的表达具有抑制作用,Car(10-6mol·L-1、10-5mol·L-1)作用相反,表现为促进表达;在模拟IR状态下,RAP、Car(10-5mol·L-1)均对Rictor mRNA的表达呈促进作用。同时加入PD98059及LY294002,PA可明显促进HUASMCs中mTOR mRNA的表达,且RAP、Car(10-5mol·L-1)可抑制该作用,Car(10-6mol·L-1)对mTOR mRNA的表达无影响。在两种培养模式下,使用PD98059和LY294002后,Raptor及Rictor mRNA的含量显著降低。利用PA刺激,二者mRNA表达显著增加。RAP对正常培养状态下Raptor及Rictor mRNA的表达具有促进作用,但在IR状态下则表现为相反作用。Car(10-5mol·L-1)对二者的表达不论是在正常还是模拟IR状态下,均呈现抑制作用。3.PHA可增加人淋巴细胞活性,促进IL-2分泌（10.400±0.582 vs 15.575±0.794,P＜0.01）,Car对正常培养及PHA诱导的淋巴细胞活性呈现浓度依赖性,Car(10-5mol·L-1、3×10-5mol·L-1)不明显影响IL-2分泌。[结论]低剂量Car对血清诱导正常及模拟IR状态培养的HUASMCs无影响,而高剂量抑制增殖。在模拟胰岛素抵抗状态下,利用PD98059和LY294002干预后,Car(10-5mol·L-1)对PA诱导的增殖具有抑制作用,可降低mTOR mRNA的表达,同时减少Raptor和RictormRNA的含量,推测Car抑制细胞增殖机制与mTOR通路密切相关,可能直接或主要作用于mTOR。同时,Car不明显影响人淋巴细胞IL-2的分泌,提示Car对机体的免疫抑制较小。Car有望开发成为影响mTOR且免疫抑制作用较小的新型细胞增殖抑制剂。

论文目录

• 英文缩略词对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究内容
• 第一部分 小豆蔻明对胰岛素抵抗状态下人血管平滑肌细胞增殖的影响及其可能机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 小豆蔻明对人淋巴细胞分泌IL-2的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 研究小结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 作者简历