人脐带不同组织来源间充质干细胞的分离培养及其免疫调控能力和支持造血的实验研究

论文摘要

间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,广泛存在于全身多种组织中。大量研究证明,MSC具有低免疫原性、多向分化潜能、调节免疫以及分离培养操作简便等特点。MSC的临床研究已经在许多国家开展,作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤等多种难治性疾病,如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等;作为免疫调节和造血支持细胞,用于治疗免疫排斥和自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病等。MSC最早在骨髓中发现,但骨髓中含量极少,且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,并且随着年龄的增长其细胞数量和扩增分化能力亦显著降低。近年来,国内外大量研究证明脐带作为胎儿发育的一部分,含有大量的多能干细胞,细胞生长扩增速度快,且脐带属于胚胎外组织,在胎儿娩出后成为“废弃物”,取材方便,来源丰富,无伦理学问题,因此,被看作是骨髓间充质干细胞的主要替代品,具有巨大的临床应用价值。不同学者分别从整条脐带、脐带的基质、脐静脉内皮中分离获得MSC,还有为数不少的学者从胎盘羊膜中分离获得MSC。考虑到脐带组织构成简单,包括表皮（羊膜上皮细胞）、基质（Wharton’s jelly）及血管,既无毛细血管也无淋巴管,但其超微结构、免疫组化和活体功能研究显示,羊膜下、血管间和血管周围区域在细胞数量和特性上均有显著差异,为此,我们拟将这三种组织分开,从中分别分离、培养、扩增MSC,并研究其生物学特性、免疫调控能力及造血支持作用,为临床应用提供重要依据。首先,我们通过机械分离及胶原酶消化法分别从人脐带的羊膜（Amnion）、基质（Wharton’s jelly）及血管（Vessel）中获得组织细胞,通过反复贴壁纯化获得AM-MSC、WJ-MSC、VS-MSC;从整条脐带（Umbilical cord）中获得UC-MSC;通过密度梯度离心法从骨髓（Bone marrow）中分离得到单个核细胞,同样通过反复贴壁纯化获得BM-MSC。然后,从细胞形态、细胞生长曲线、细胞周期、多向分化潜能特性及细胞免疫表型五个方面进行比较和鉴定。结果表明,五组MSC具有相似的生物学特征:1)细胞培养至第3代细胞形态相对均一,为典型的成纤维样,呈平行或漩涡状排列;2)细胞具有强大的体外扩增能力;3)均有80%以上的细胞处于G0/G1,提示脐带不同来源的MSC同BM-MSC一样均具有典型的干细胞增殖特点,即只有少数细胞处于活跃的增殖期;但BM-MSC的培养需添加低浓度的细胞生长因子bFGF,且培养至5代后扩增能力逐渐减低,而脐带来源的MSC仅在低营养条件下即能大量扩增,传代至第14代,细胞生物学特性无明显改变;4)对其诱导多向分化,结果表明,细胞可向成骨、成脂肪和成软骨方向分化,但与BM-MSC相比脐带来源的MSC成骨能力略低,脐带来源的MSC各组间无差异;5)流式细胞仪检测细胞免疫表型,结果表明,脐带不同组织来源的MSC同BM-MSC类似,均表达间充质干细胞特异性抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、HLA-ABC及多能干细胞标志物TRA-1-60,低表达或不表达造血及内皮细胞表面标志即CD14、CD31、CD34、CD45,以及移植免疫排斥相关的表面标志HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L;各组细胞表型进行比较,CD166表达有显著差异,CD31、CD106、HLA-DR的表达具有高度的显著差异。其次,通过淋巴母细胞转化实验及混合淋巴细胞反应检测其免疫调控能力。结果表明,对于有丝分裂原及异体抗原诱导的T淋巴细胞的增殖各组MSC均有抑制作用,且这种抑制作用具有剂量依赖性,随MSC的细胞数量逐渐增加,其抑制效应逐渐增强;实时定量PCR和RT-PCR方法检测与免疫相关的细胞因子IL-10、IL-11和TGF-β1的表达亦无显著差别,但UC-MSC组分泌的IL-6与WJ-MSC、VS-MSC、AM-MSC、BM-MSC组相比差异极其显著（P=0.0000）,WJ-MSC与AM-MSC相比也有明显差别（p=0.008）。最后,探讨脐带不同组织来源的MSC的造血支持作用。以脐带不同组织来源的MSC为饲养层,与脐带血造血干/祖细胞在无血清培养体系下共培养7天,检测有核细胞、CD34+细胞和造血集落的扩增效率。结果显示,MSC可以在体外有效支持造血干/祖细胞的扩增,与对照组相比差异高度显著;且UC-MSC组的有核细胞、CD34+细胞及CFU-C的扩增效率均显著高于WJ-MSC、VS-MSC和AM-MSC组,多能干细胞集落CFU-Mix的扩增效率未见显著差异;后三者之间进行比较,WJ-MSC组和VS-MSC组对红系祖细胞及粒、单核系祖细胞的扩增效率高于AM-MSC组,且经实时定量PCR和RT-PCR方法检测MSC分泌的造血生长因子的mRNA相对表达量,其差异也支持了这一结论,其中IL-3、IL-11、HGF、TPO、EPO、VEGF、M-CSF和G-CSF的表达水平无显著差异,而UC-MSC组IL-6、SCF、FLT3、LIF的表达量显著高于其它各组。上述结果提示,脐带不同组织来源的MSC的生物学特性及免疫调控作用与骨髓来源的MSC无明显差异,但在支持造血的功能有所不同,随着对MSC研究的不断深入,其应用的范围将更为广泛。而作为种子细胞,不同组织来源的MSC的功能亦有不同,值得我们进一步深入探讨和研究。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 脐带羊膜、Wharton’s jelly、血管及骨髓来源的间充质干细胞的分离培养及生物学特性的鉴定
• 实验流程
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 不同组织来源的间充质干细胞的免疫调控能力
• 实验流程
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 脐带不同组织来源间充质干细胞的造血支持作用
• 实验设计
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢