论文摘要
目的:过度训练是由于运动训练负荷过大,超过机体的承受能力,导致多器官功能紊乱的病理状态。如何防治运动损伤是目前运动医学、军事医学和临床医学的重大课题。中药唐古特莨菪提取物山莨菪碱具有解除血管痉挛、改善微循环的作用,对缺血性急性肾损伤具有防治作用。本研究通过让大鼠游泳至力竭,建立过度训练致急性肾损伤（overtraining- induced acute kidney injury,OTIAKI）模型,研究大鼠力竭后不同时间线粒体蛋白Smac/DIABLO、细胞X-连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）表达的变化,观察了山莨菪碱对上述变化的影响,旨在加深对OTIAKI发病机制的认识,为临床OTIAKI的防治提供新的理论和实验依据。方法:1.分组:雄性Wistar大鼠36只,体重200-220g,随机分为安静对照组（control,CN,n=6）、力竭运动组（exhaustive swimming,ES,n=18）、山莨菪碱干预组（Anisodamine, AD,n=12）。CN组为安静对照;ES组又根据力竭后恢复时间分为力竭后即刻（ESI）、力竭后6h（ES 6h）和力竭后24h （ES 24h）;AD组于力竭运动前20 min腹腔注射山莨菪碱10 mg/kg后进行力竭运动,分为AD 6h和AD 24h组。每个时间点6只大鼠。2.动物模型的建立:采用大鼠无负重游泳至力竭建立过度训练致急性肾损伤动物模型。各实验组大鼠于实验前一天适应性游泳30分钟,第二天再次放于水中,游泳直至力竭。力竭标准为:①沉入水底超过10秒钟;②游泳动作明显不协调;③捞出后没有逃避反应,且放在平面无法完成翻正反射（个别大鼠有假死的现象,要注意判断）。3.取材:力竭后即刻组大鼠于力竭后即刻使用乙醚麻醉,麻醉理想后于腹部正中切开,摘除双肾,纵形剖开,一半置入40C 4%多聚甲醛中固定,备行石蜡切片,另一半置于-800C冰箱保存,待行Western blot检测。其余各实验组也于相应时间点采用同样的方法取材。4.应用免疫组化（SP法及PV法）检测大鼠力竭后不同时间肾组织线粒体蛋白Smac/DIABLO和细胞X-连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达情况。5.应用Western blot检测大鼠力竭后不同时间线粒体蛋白Smac/DIABLO、XIAP和Caspase-9表达情况。6.应用图象分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。7.所有数据均采用均数±标准差（X±S）表示,SPSS 12.0软件包进行统计分析,组间差异用单因素方差分析,p<0.05认为有统计学意义。结果:1.各组大鼠肾组织Smac/DIABLO表达的变化:对照组大鼠肾组织Smac/DIABLO表达很少,力竭后即刻组大鼠肾组织中Smac/DIABLO与对照组比较明显增高（p<0.05）;力竭后6h及24h继续增高（p<0.05）;山莨菪碱6h组和24h组大鼠与同期单纯力竭组比较,肾组织Smac/DIABLO的表达均显著降低（p<0.05）,但仍然高于对照组水平（p<0.05）。2.各组大鼠肾组织XIAP表达的变化:对照组大鼠肾组织可见XIAP表达,力竭后即刻组大鼠肾组织XIAP表达与对照组比较明显降低（p<0.05）,力竭后6h及24h大鼠肾组织XIAP表达进一步降低（p<0.05）;山莨菪碱6h组及24h组大鼠肾组织XIAP表达明显高于同期单纯力竭组（p<0.05）,但尚未达对照组水平（p<0.05）。3.各组大鼠肾组织Caspase-9表达的变化:力竭运动后Caspase-9的表达随力竭后恢复时间的延长而逐渐增强,各力竭组同正常对照组相比均有统计学意义（p<0.05）,山莨菪碱6h组及24h组大鼠肾组织Caspase-9表达均比同期单纯力竭组明显降低（p<0.05）,但仍然高于对照组水平（p<0.05）。结论:1.力竭后肾组织Smac/DIABLO、Caspase-9的表达随力竭运动后时间延长而增强,XIAP在力竭运动后表达下降,说明Smac/DIABLO与Caspase-9竞争性结合XIAP,去除了XIAP对Caspase-9的抑制作用,这可能是过度训练引起肾组织细胞凋亡的重要分子机制之一。2.山莨菪碱可降低力竭运动后Smac/DIABLO的表达,提高XIAP活性,抑制Caspas-9的表达活性,这可能是山莨菪碱抑制过度训练致肾组织细胞凋亡,进而发挥肾脏保护作用的分子机制之一。
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