论文摘要
目的:股骨头缺血性坏死（avascular necrosis of the femoral head,ANFH）一直是骨科界的难题之一,已有研究证实,ANFH患者全身性骨髓活性下降,骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向脂肪细胞转化增多,相应地导致向成骨细胞转化减少,以致成骨细胞数量减少和骨髓成骨能力下降。目前,临床对于FicatⅠ-Ⅲ期ANFH患者尚无特别有效的治疗方法。体外冲击波疗法（extracorporeal shock wave therapy,ESWT）是一种用于治疗骨肌系统疾病的新兴无创的治疗手段,近年来国内外报道将ESWT用于治疗早中期ANFH,取得了较为满意的疗效。核心结合因子alpha1（core binding factor alpha1,Cbfα1）不仅是成骨细胞特异性转录因子,而且对软骨细胞成熟、破骨细胞发育分化以及新生血管生成入侵软骨组织的过程也起重要调节作用。体外冲击波（extracorporeal shock wave,ESW）干预ANFH患者MSCs后Cbfα1mRNA如何表达,目前国内外未见相关报道,本实验围绕这一中心展开研究,以期从分子生物学水平解释ESWT治疗ANFH的有效性。方法:本研究采用密度梯度离心法结合贴壁法体外分离培养ANFH患者MSCs;根据随机原则将ANFH患者MSCs分为A组（ESW干预组）、B组（空白对照组）;经最适能流密度（5kv/500频次）干预后,采用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）法检测A、B两组不同时间点的光吸收（optical density,OD）值,比较细胞的增殖差异;应用改良Gomori钙钴法和茜素红染色分别检测细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和胞外基质矿化程度,观察比较A、B两组细胞成骨分化差异;采用RT-PCR法结合光密度相对值半定量分析不同时间点Cbfα1mRNA和OCmRNA两组表达量的差异。对上述各部分数据采用相应的统计学方法进行分析。结果:1.原代细胞光镜下呈圆形,大小不一,数目较多,胞体折光性强,核呈椭圆形;24小时后即可观察到部分细胞贴壁,48小时后贴壁细胞增多,有集落出现;5-7天后贴壁细胞呈克隆性集落生长,细胞形态部分转变为长梭形;大约两周原代培养的细胞相互融合达到生长表面的85%时即可传代;2.传代细胞A组早期呈集落样生长;4-5天即可进入增殖高峰期,核分裂相多,呈规则的方向性排列,绝大多数呈长梭形,后期细胞多呈对称分裂,呈旋涡样网状生长,由梭形变为宽大平坦的带状或多边状,表现出成骨分化趋势;B组进入增殖高峰期较晚,排列方向性差,且随着时间延长,细胞出现不对称分裂和多种分裂方式,两个子细胞形态、大小不一,细胞器出现非等量分割,存在向其他类型细胞多向分化的表现;3.细胞生死检测试剂盒染色检测发现,A组经ESW（5KV/500频次）干预后,细胞活性与B组相比差异无显著性差异。生长曲线显示:A组从第2天开始OD值逐渐增加,6天后达到峰值,随后进入平台期;B组第3天开始OD值明显增加,第7天达到峰值,随后进入平台期。A、B两组比较显示,第1天时间点无明显差异（P>0.05）,其余各时间点均有显著性差异（P<0.05）;4.改良钙钴法检测显示,A、B两组细胞经不同方法处理后6天均可发现ALP染色阳性,阳性率无明显差异（P>0.05）;随着培养时间的延长,两组ALP染色强度均明显增强,A组更为明显,胞内外均有大量致密的黑色沉淀,染色强度明显强于B组;B组虽有部分呈阳性,但强度较弱,只有在胞浆可以看到散在分布的灰棕色沉淀,没有大片的黑色沉淀,且细胞大小不一、形态多样、胞界清晰。细胞ALP染色阳性率显示,曲线均呈S型,A、B两组各时间点（除6天时间点）组间均有显著性差异（P<0.05）,在24天时间点A组平均阳性率为90%,B组直至36天平均阳性率才上升至50%左右;5.茜素红法钙化结节染色显示:A组P7细胞培养20天,细胞长满瓶底,呈多边形成骨细胞状,局部复层丛集生长,肉眼可见白色结节状区域,茜素红染色可见大量橘红色的钙化结节;B组P7细胞形态不规则,肉眼未见白色结节状区域,茜素红染色可见少量分散的结节状物质,100倍镜下随机选取3个视野进行计数,结果A组矿化结节数为7.0±1.3,B组无明显结节,染色始终为阴性;6. PCR产物显示,A、B两组分别干预后第3天均检测到Cbfα1mRNA表达,A组明显强于B组;干预后第12天,A组检测到骨钙蛋白（osteocalcin,OC）mRNA的表达,B组第18天才有微弱表达,后期表达均逐渐增强。光密度半定量分析显示,Cbfα1mRNA在ESW诱导成骨分化的整个过程中持续表达,并在第12天时间点达到峰值,15天时间点表达量有所减弱,除第3天时A、B两组无显著性差异（P>0.05）,其余时间点A、B两组相比均有显著性差异（P<0.01）;OCmRNA的表达A组先于B组且光密度明显强于B组,两组比较12、18、24天时间点均有显著性差异（P<0.01）。结论:1.适当强度的ESW可促进ANFH患者MSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化;2. ESW作用ANFH患者MSCs后ALP分泌增加及细胞外基质矿化,表明ESW可促使其向成骨细胞分化并趋向成熟;3. Cbfα1mRNA的表达是ANFH患者MSCs成骨分化的早期表达产物,其先于OC的出现,并在ANFH患者MSCs成骨分化的全过程中持续表达;OCmRNA在ANFH患者MSCs细胞矿化期表达,是基质矿化的关键因素;4. ESW促进ANFH患者MSCs增殖,诱导其成骨分化及增强Cbfα1mRNA的表达是ESWT治疗ANFH的有效机制;5. ESWT联合MSCs移植可能是今后临床治疗ANFH以及其他骨修复能力受限性疾病的一种积极有效的方法。
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标签：体外冲击波论文; 股骨头缺血性坏死论文; 骨髓间充质干细胞论文; 核心结合因子论文;