论文摘要
目的:急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease, aGVHD）是异基因造血干细胞移植（ allogene hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）的主要障碍之一。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）是存在于骨髓中的非造血干细胞,能够促进造血重建,减轻GVHD,在造血干细胞移植中发挥免疫调节作用。由于其低免疫原性,而被认为是防治GVHD的新方法。为研究异基因造血干细胞移植时共同输入供体或第三者间充质干细胞均可能减轻GVHD,本实验利用纯系小鼠C57BL/6H-2b→BALB/cH-2d建立MHC不相合造血干细胞移植后aGVHD动物模型,将封闭群KM小鼠的BMMSCs经体外培养后与供鼠的脾脏及骨髓细胞进行联合移植,探讨第三者来源的不同数量的BMMSCs在异基因造血干细胞移植中对aGVHD、移植后造血重建及免疫恢复的影响。方法1实验动物清洁级造血干细胞供鼠C57BL/6H-2b（B6）, 68周龄,雌雄兼用;受鼠BALB/cH-2d,68周龄,雌雄兼用;第三者BMMSCs供鼠:KM小鼠,68周龄,雌雄兼用。以上动物由河北省实验动物中心提供,合格证编号为803177。饲养于百级层流洁净动物饲养柜。2 BMMSCs的培养、扩增将BMMSCs供鼠颈椎脱臼处死,无菌分离小鼠股骨及胫骨,以含F12-DMEM为完全培养基（CCM,含青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、HEPES液0.03mol/L以及20%FBS）冲出骨髓。直接接种于25cm2一次性无菌塑料培养瓶中,37℃,5%CO2饱和湿度培养。48小时后行首次半量换液,4天后进行全量换液,去除悬浮细胞,此后每3～4天换液一次,当贴壁细胞层达到90%以上融合时,以0.25%胰酶消化,传至第3代以后的细胞,纯度>90%用于移植。3制备小鼠脾脏（spleen cells, SPC）及骨髓细胞（bone marrow cells, BMC）取供鼠C57BL/6脱颈椎处死后,无菌分离脾脏、双侧股骨和胫骨。常规制备SPC及BMC悬液。锥虫蓝计数,拒染率>95%,调整至所需细胞浓度备用。4建立MHC不相合移植动物模型供受鼠均于移植前3天开始饮用盐酸酸化水;受鼠BALB/c于移植当天接受60Coγ射线致死性全身照射（total-body irradiation, TBI）10Gy,剂量率为0.63Gy/min,4小时内按移植分组要求进行骨髓、脾淋巴细胞混合移植,移植量为:（BMC 5×106+SPC 1×107）B6/0.2ml/鼠,实验组需同时输注不同来源不同剂量的BMMSCs/0.2ml/鼠,对照组输注生理盐水/0.2ml/鼠。5动物分组a单纯TBI组BALB/c +TBIb异基因移植组BALB/c +TBI + （BMC+SPC）B6c异基因移植+供者BMMSCs组BALB/c +TBI + （BMC+SPC） B6 + MSC B6 （5×105）d异基因移植+低剂量第三者BMMSCs组BALB/c +TBI + （BMC+SPC） B6 + MSCKM（5×103）e异基因移植+中剂量第三者BMMSCs组BALB/c +TBI + （BMC+SPC） B6 + MSCKM （5×104）f异基因移植+高剂量第三者BMMSCs组BALB/c +TBI + （BMC+SPC） B6 + MSCKM （5×105）注:每组动物4～5只（不包括在移植后不同时间活杀,留取标本的动物）,每组实验重复2次。6结果判定移植失败:动物死亡时WBC≤1×109/L,或d+15后WBC≤1×109/L。GVHD:WBC>1.5×109/L并伴有以下症状3种以上:精神萎靡、翘毛、脱毛、皮损、腹泻、弓背、眼炎、体重骤减甚至死亡。上述症状在d+10内出现为超急性GVHD;d+10～d+30出现为aGVHD。生存期>30天为长期生存。移植物植活:连续两次WBC>1×109/L。择时取肺、肝、小肠进行病理检查。7移植动物观察内容移植后每天观察小鼠进食及精神状况,称量体重,记录小鼠的存活时间。有无aGVHD的表现。隔日采集小鼠尾静脉血,计数WBC数。在植入后第7天,取心脏血约0.3ml,应用流式细胞术检测CD4+和CD8+细胞含量,计算CD4+/CD8+比值。取移植后7天的各组小鼠骨髓细胞,甲基纤维素半固体培养检测CFU-GM生成率。8统计学分析SPSS13.0软件分析,分组资料以均数士标准差表示,进行t检验;绘制Kaplan-meier生存曲线。结果1第三者BMMSCs对造血重建的影响1.1造血重建的时间所有移植组的外周血白细胞均于+3d达最低水平,且各组均成功植入。a、b、c、d、e、f各组植入时间为:0d、6.7±1.3d、5.0±0.7d、5.7±0.8d、4.8±1.2d、4.6±1.0d。c、d、e、f组与b组相比较,造血重建时间明显缩短（P<0.01）;c组与f组相比较造血重建时间无差别（P>0.05）;d、e、f各组间进行比较:d组与f组相比,造血重建时间有明显差别（P<0.01）;d、e组及e、f组间比较均无明显差别（P>0.05）。1.2 CFU-GM集落计数a、b、c、d、e、f各组每孔CFU-GM集落计数为:0、23.0±2.0、60.9±2.2、23.4±3.1、49.6±2.3、60.1±3.0。c、e、f组与b组比较,CFU-GM集落计数明显增加（P<0.01）;d组与b组的CFU-GM集落计数比较无明显差别（P>0.05）。d、e、f各组间进行比较,各组间均有明显差别（P<0.01）。2第三者BMMSCs对aGVHD发生的影响2.1 aGVHD发生及生存时间进行异基因移植各组的小鼠的体重随着GVHD的出现呈下降趋势。b组于+3～+5d出现超急性GVHD的表现;c组和f组小鼠+9～+12d发生aGVHD,较b组出现时间明显延迟,且GVHD程度较轻;d组小鼠出现aGVHD的时间约为+3～+5d;e组小鼠出现aGVHD的时间为+7～+9d。a、b、c、d、e、f各组小鼠的生存时间为:8.5±1.0d、7.8±0.8d、22.3±4.1d、8.9±1.0d、14.9±1.6d、22.5±2.3d。c、d、e、f组与b组比较生存时间明显延长（P<0.05）;c组与f组相比较生存时间无差别（P>0.05）;d、e、f各组间进行比较:各组间均有明显差别（P<0.01）。2.2病理组织学观察各组GVHD发生时病理的基本变化一致。b组病变程度最为显著:肺组织充血,肺泡腔出血明显;肝细胞水肿并伴有大片灶性坏死,汇管区及中央静脉和肝血窦明显扩张、淤血;小肠腺体及局部粘膜上皮坏死,肠腔内有大量脱落的坏死上皮细胞。c、d、e、f各组病变程度则明显减轻,其各组间病理变化相似。3移植后免疫细胞恢复情况在植入后7天,存活的c、d、f组,其CD4+细胞分别为5.59%,7.85%,6.74%; CD8+细胞分别为14.37%,13.16%,15.19%。与正常小鼠比较（CD4:44.40%,CD8:10.26%）,CD4+细胞均明显减少,而CD8+细胞明显增高,CD4+/ CD8+比例倒置,分别为0.39,0.60,0.44（正常对照:4.33）。结论1第三者BMMSCs在MHC不相合造血干细胞移植中可以减轻aGVHD,延长生存,促进移植后造血重建;与供者BMMSCs作用无明显差别。2第三者BMMSCs减轻aGVHD、延长生存、促进造血重建的作用与植入BMMSCs数量呈正相关。
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