猕猴溶组织内阿米巴原虫病病原分离鉴定及凝集素hgl基因的原核表达

论文摘要

本研究从猕猴阿米巴病例的腹泻粪样中分离到一株阿米巴原虫,该原虫经过实验室的培养和形态学观察后,初步鉴定为溶组织内阿米巴或迪斯帕内阿米巴,采用鉴别溶组织内阿米巴和迪斯帕内阿米巴的虫种特异性引物,对阿米巴原虫peroxiredoxin基因进行PCR扩增,结果显示溶组织内阿米巴特异性引物扩增出了相应大小的DNA片断,经过克隆后测序,序列分析（登录号为:EU022309）显示本虫株与人溶组织内阿米巴株序列同源性为98%—99%,而与人迪斯帕内阿米巴株序列同源性仅为89%,鉴定该阿米巴猕猴分离株为溶组织内阿米巴,命名为Entamoeba histolytica MH530株。参照GenBank中收录的人溶组织内阿米巴原虫半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素的重链hgl基因序列设计一对引物,通过PCR扩增获得与预期相符的产物,经过克隆后测序,得到1761bp的有效基因序列。通过对该基因核苷酸序列和推导的氨基酸进行分析,结果表明核苷酸序列与人溶组织内阿米巴的序列同源性在93.44%-96.21%之间,与人迪斯帕内阿米巴的序列同源性为87.44%。该基因编码了一个有587个AA的多肽,分子量为65.514KD,等电点理论值为5.17,具有较强的亲水性,蛋白抗原性分析显示其抗原位点分布于整个蛋白质多肽链。该序列已登录在GenBank上（登录号为EU244479）。根据获得的基因序列设计一对表达引物,对其中重要的含多个抗原决定簇的LC3段进行原核表达,制备目的基因和表达载体,将目的片断插入pET32 b（+）表达载体上,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用1.0mM/L的IPTG诱导表达了猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段,SDS—PAGE分析表明,在相对分子质量约66KD处出有明显的蛋白质表达条带,而对照组pET32 b（+）空质粒菌在此处没有条带,该蛋白在3h时基本达到表达量最大值,而IPTG浓度在0.05mM/L和2.0mM/L之间没有明显表达差异,均都得到了很好的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 第二章 猕猴溶组织内阿米巴的分离培养及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验样品来源
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 菌株和克隆载体
• 1.1.4 常用缓冲溶液和培养基的配制
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.1.6 主要生物信息学数据库和计算机软件
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 阿米巴的分离培养
• 1.2.2 形态观察
• 1.2.3 溶组织内阿米巴的分子鉴定
• 2 实验结果
• 2.1 粪检及培养
• 2.2 形态观察
• 2.3 虫种分子鉴定
• 2.3.1 种特异性引物的PCR扩增
• 2.3.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
• 2.3.3 重组克隆质粒的测序鉴定
• 2.3.4 序列分析
• 3 讨论
• 第三章 溶组织内阿米巴凝集素基因hgl链LC3段的克隆及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 虫株、菌株及质粒载体
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要溶液的配制
• 1.1.5 主要生物信息数据库和计算机软件
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段的克隆
• 1.2.2 溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段的原核表达载体构建
• 1.2.3 重组pET32b-hglLC3质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 2 实验结果
• 2.1 凝集素hgl基因的克隆测序
• 2.1.1 凝集素hgl基因的PCR扩增
• 2.1.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
• 2.1.3 重组克隆质粒的测序鉴定
• 2.1.4 重组克隆质粒的序列分析
• 2.1.5 该基因片断的蛋白质生物信息学分析
• 2.2 hgl基因的亚克隆
• 2.2.1 加酶切位点引物的PCR扩增
• 2.2.2 重组质粒的PCR鉴定
• 2.3 凝集素hgl基因LC3段重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.3.1 重组表达质粒的双酶切鉴定
• 2.3.2 重组表达质粒的测序鉴定
• 2.3.3 重组表达蛋白质同源性分析
• 2.4 凝集素重组表达质粒的表达产物SDS-PAGE电泳
• 2.4.1 诱导鉴定
• 2.4.2 IPTG浓度梯度
• 2.4.3 时间梯度
• 3 讨论
• 3.1 关于溶组织内阿米巴凝集素的研究
• 3.2 关于猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因的扩增
• 3.3 关于hgl基因在原核表达系统PET32b（+）中的表达
• 3.4 基于凝集素的杭溶组织内阿米巴疫苗研究
• 4 结论
• 5 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间论文发表