褪黑素合成酶基因转化体系的建立及外源褪黑素对菘蓝生长的调节

论文摘要

菘蓝（Isatisin digotica Fort.）为十字花科（cruciferae）菘蓝属（Isatis Linn）2年生草本植物。在中药中,菘蓝的干燥根称为板蓝根,干燥叶为大青叶。褪黑素在植物中广泛存在,文献报导褪黑素可作为植物激素调节植物生长；保护植物免受胁迫环境的伤害,增加植物的抗逆性。本试验以菘蓝为研究材料,在建立离体培养再生体系的基础上,将哺乳动物褪黑素生物合成途径中的酶AANAT和HIOMT基因转入菘蓝,获得表达异源褪黑素的转基因菘蓝；高效液相色谱法检测转基因植株中褪黑素和靛玉红含量；同时探究了外源褪黑素对菘蓝分化、生根的影响以及冷胁迫处理菘蓝种子萌发的保护作用。本研究的具体研究成果如下：（1）以菘蓝的根段、下胚轴、叶片为外植体,置于不同激素配比的MS培养基上均可建立菘蓝离体培养再生体系。根段可在附加不同浓度的6-BA和NAA的MS固体培养基,100%分化产生丛生芽,且分化时间短至3-7 d,形成的丛生芽茁壮；在含IBA 0.4mg/L的MS培养基上生根。确定菘蓝的根段为菘蓝离体培养的最佳外植体。（2）获得转褪黑素合成酶基因的菘蓝：通过农杆菌介导法将褪黑素合成酶AANAT和HIOMT基因导入菘蓝根段外植体。经A6000.5-0.7的农杆菌菌液浸染根段6 min,共培养3 d,而后转移至附加50 mg/L Gen.的筛选培养基上培养,获得转化再生植株。PCR、RT-PCR检测证明基因AANAT和HIOMT已经整合到菘蓝的基因组中并表达。（3）从菘蓝植株中提取褪黑素和靛玉红,高效液相色谱法检测转基因植株、田间苗和种子苗中的褪黑素和靛玉红含量,其中转基因植株中褪黑素含量最高可达对照的4倍,但低于田间苗含量。探讨了菘蓝中褪黑素和主效成分靛玉红含量与生长环境的关系。（4）外源褪黑素对菘蓝的生理作用：菘蓝叶片在附加MT 0.2 mg/L的MS培养基可形成单体完整植株；不定芽在附加MT 0.4 mg/L的MS培养基生根率是90.8%,与同等浓度IBA作用一致。表明褪黑素可促进菘蓝叶片分化,不定芽生根,具有调节植物生长特性。100μM的MT处理菘蓝种子可以保护菘蓝种子免受胁迫伤害,萌发率与未受冷胁迫相当。

论文目录

• 中英文缩略词对照表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 菘蓝的研究进展
• 1.1 菘蓝的植物学研究
• 1.2 菘蓝的化学成分
• 1.3 板蓝根,大青叶的药理作用
• 1.4 植物生物技术在菘蓝中的应用
• 2 植物中褪黑素的研究
• 2.1 褪黑素在生物体的合成
• 2.2 褪黑素的定量分析
• 2.3 植物体内褪黑素的作用
• 4 研究内容及目的意义
• 第二章 菘蓝离体再生系统的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 无菌苗的获取
• 2.2 菘蓝分化培养
• 2.3 不定芽生根
• 2.4 炼苗、移栽
• 2.5 组织学分析
• 2.6 数据统计
• 3 结果与分析
• 0固体培养基上分化'>3.1 下胚轴在附加不同激素的MS₀固体培养基上分化
• 0固体培养基上分化'>3.2 叶片在附加不同激素的MS₀固体培养基上分化
• 3.3 根在固体培养基上分化形成不定芽
• 3.4 根、下胚轴在液体培养基中分化
• 3.5 诱导生根
• 4 讨论
• 第三章 农杆菌介导的转褪黑素合成酶基因的遗传转化
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 农杆菌菌株和质粒
• 1.3 试验试剂
• 2 试验方法
• 2.1 菘蓝外植体对庆大霉素的敏感性试验
• 2.2 农杆菌的活化
• 2.3 外植体转化
• 2.4 外源基因的整合鉴定
• 2.5 外源基因的表达鉴定
• 2.6 HPLC检测菘蓝中的褪黑素,靛玉红含量
• 3 结果与分析
• 3.1 庆大霉素浓度确定
• 3.2 预培养时间对菘蓝根段转化的影响
• 3.3 菌液浓度对转化效率的影响
• 3.4 共培养时间对转化效率的影响
• 3.5 转AANAT、HIOMT基因菘蓝的获得
• 3.6 转基因菘蓝褪黑素合成酶基因AANAT和HIOMT的PCR的检测
• 3.7 AANAT和HIOMT基因阳性转基因菘蓝RT-PCR检测
• 3.8 HPLC检测菘蓝中的褪黑素,靛玉红结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 外源褪黑素对菘蓝的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 褪黑素对菘蓝叶片分化的影响
• 2.2 褪黑素对菘蓝生根的影响
• 2.3 褪黑素对低温胁迫下种子萌发的影响
• 2.4 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 褪黑素促进菘蓝叶片分化
• 3.2 褪黑素对菘蓝生根的影响
• 3.3 褪黑素对菘蓝种子萌发的影响
• 4 讨论
• 总结
• 1. 研究结论
• 2. 本研究创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果
• 致谢