乙型脑炎病毒—伪狂犬病病毒二联基因工程疫苗研究

论文摘要

乙型脑炎病毒和伪狂犬病病毒都是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一,给养猪业造成巨大的经济损失。而且乙型脑炎是一种人畜共患病,猪是乙脑病毒的主要放大宿主,因此对猪乙脑病毒的控制具有十分重要的公共卫生意义。两种病原都是病毒,预防控制的主要措施除了常规的生物安全外,就是疫苗预防接种。目前尚无家畜专用的JEV疫苗株,主要用人类疫苗使用的弱毒株和强毒株。同时由于现代化养殖中猪群频繁接种,对猪群造成很大的应激,严重影响生产性能。目前,国际上动物用疫苗的发展趋势是标记疫苗及其配套的监测方法。鉴于此,本研究从乙脑病毒CQRC-1株扩增了主要免疫原性基因E、PrM,构建了两株表达乙脑病毒主要免疫原性基因的重组伪狂犬病病毒,即SA215（E）和SA215（F）,并对两株重组病毒进行生物学特性研究。同时重组疫苗接种后需要一种特异的血清学鉴别方法,鉴于此对乙脑病毒非结构蛋白基因NS1进行原核表达,并建立了ELSIA方法。其主要的研究内容如下:1.乙脑病毒PrM、E、NS1和NS3基因的克隆和测序根据已报道的乙脑病毒CQRC-1株的核苷酸序列设计四对引物,在上下游引物的5’端引入一酶切位点。采用RT-PCR方法,扩增了PrM、E、NS1和NS3基因,分别利用TA克隆插入pMD18-Tsimple载体,命名为PrM-T、E-T、NS1-T和NS3-T。测序结果表明E基因与已公布的SA14、JaGAr01和P3株核苷酸同源性分别为97、97、96%;PrM同源性分别为97、97、96%;NS1同源性高达99、98、98%;NS3核苷酸同源性分别为99、98、98%;与报道的CQRC-1的对应序列相同。2.表达JEV E和PrM基因的重组伪狂犬病病毒的构建从E-T和PrM-T酶切获得JEV的E基因和PrM基因,分别插入到PRV gI基因缺失通用转移载体pPI-2.EGFP的多克隆位点中,构建转移质粒,命名为PPE和PPM。然后将质粒PPE和PPM分别与PRV基因缺失株SA215基因组共转染Vero细胞,通过同源重组,构建了融合表达JEV E基因和JEV PrM基因的重组伪狂犬病毒株,命名为SA215（E）和SA215（F）。经荧光检测、PCR、Southern转印杂交鉴定,结果表明SA215（E）和SA215（F）构建成功;Western免疫印迹检测表明JEV E基因和JEV PrM基因在重组病毒内获得表达,SA215（E）产生大小约90kD的融合蛋白;而SA215（F）产生大小约60kD融合蛋白,并且,表明产生的融合蛋白具有反应原性。3.重组病毒SA215（E）、（F）部分生物学特性及稳定性SA215（E）、（F）和SA215对Vero细胞的致病变效应、噬斑形态、一步法生长曲线试验以及电子显微镜观察病毒粒子形态特征。结果表明SA215在插入了JEV E或PrM基因后,并不改变其生物学特性。SA215（E）、（F）连续传6带,在荧光显微镜下可见荧光,用PCR跟踪检测仍可扩增出JEV E基因或PrM基因,表明SA215（E）、（F）至少在6代内稳定。4.PRV-JEV二联基因工程疫苗对仔猪、小鼠和家兔的免疫原性和安全性试验将重组伪狂犬病毒SA215（E）和（F）制成PRV-JEV二联基因工程疫苗接种小鼠、家兔和仔猪。并对该疫苗的免疫原性和安全性进行评价。重组伪狂犬病毒SA215（E）、SA215（F）、SA215和野毒Fa株分别以105TCID50剂量接种小鼠,结果接种Fa株小鼠全部死亡,而接种SA215（E）、（F）和SA215株的小鼠全部存活;将四株分别以107TCID50接种家兔,接种Fa的家兔在14天全都死亡,而接种SA215（E）、（F）和SA215株的家兔全部存活;初生仔猪接种SA215（E）和SA215（F）后除前三天体温升高外,其他正常。这些结果表明SA215（E）和（F）株的毒力显著低于PRV野毒株,而与亲本株SA215相近,初步验证了重组病毒的安全性。将PRV-JEV二联基因工程疫苗SA215（E）、（F）及SA215分别加强免疫小鼠后,腹膜内攻毒JEV强毒株CQRC-1,结果显示SA215（E）能100%（8/8）的保护,SA215（F）仅50%（4/8）保护,而SA215完全不能保护小鼠JEV攻毒（0/8）;血清中和试验表明SA215（E）接种两次后即首免后28天中和抗体滴度达1:20,而SA215（F）仅为1:4。SA215（E）、SA215（F）和SA215以107TCID50接种家兔两次后,用107TCID50 PRV Fa株攻毒,SA215（E）、（F）和SA215都能100%（4/4）保护PRV强毒攻毒。淋巴细胞增殖试验（MTT法）结果显示SA215（E）和（F）能诱导小鼠特异脾淋巴细胞的增殖;而T细胞亚类数量的检测结果显示SA215（E）和SA215（F）免疫小鼠能有效提高T细胞数量,增强小鼠的免疫水平。这些结果表明重组伪狂犬病毒SA215（E）和SA215（F）制成的PRV-JEV二联基因工程疫苗能成功诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。以上结果表明重组病毒SA215（E）可以作为预防猪乙脑和伪狂犬病的二联基因工程标记疫苗候选株。5.对已构建好的重组质粒NS1-T和NS3-T通过双酶切后。得到JEV NS1和NS3基因,将其亚克隆入原核表达载体pET-32a（+）中。在IPTG的诱导下,NS1和NS3基因以融合蛋白的形式进行表达。通过表达条件的优化,确立了NS1蛋白表达时的最佳诱导物浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为37℃。以纯化的融合蛋白为抗原包被酶标板,优化抗原最佳包被浓度为10μg/ml,血清稀释度1:40,最适封闭液为1%BSA,血清反应时间为90min,酶标二抗HRP-SPA的工作浓度为1:2000,反应时间为60min,底物在室温显色时间为10min。根据已建立的ELISA方法及反应条件,确定阴阳性临界值为0.152。以建立的方法检测JEV血清学反应,能区分活毒感染与灭活疫苗接种,可作为二联基因工程疫苗SA215（E）的配套监测方法。

论文目录

中文摘要

Abstract

前言

第一章文献综述

第一部分日本脑炎病毒研究进展

1 概述

2 病原学

2.1 理化特性

2.2 抗原性

2.3 致病性

2.4 血凝特性

2.5 培养特性

3 持续性感染

4 流行病学

4.1 传染源

4.2 传播媒介

4.3 易感动物

4.4 分布和季节

5 分子生物学

5.1 病毒的结构

5.2 病毒基因组的结构

5.3 JEV生物合成

5.4 病毒结构基因编码的蛋白

5.5 分子毒力机制

6 病理及致病机理

6.1 病理

6.2 发病机理

6.3 脑炎发病与抗病机制

7 诊断方法

7.1 病毒分离鉴定

7.2 病原学检查

7.3 血清学检测方法

8 疫苗

8.1 灭活疫苗

8.2 减毒活疫苗

8.3 发展中的乙脑疫苗

8.4 展望

第二部分伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究进展

1 伪狂犬病毒载体的优越性

2 重组伪狂犬病毒的构建策略

3 外源基因在重组伪狂犬病毒中的表达及生物学活性

4 重组疫苗的安全性、应用前景及存在的问题

研究的目的和意义

第二章 PRV-JE二联基因工程疫苗的研究

1 实验材料

1.1 毒种与细胞

1.2 菌种与质粒

1.3 研究中所用的引物

1.4 主要的药品及试剂

1.5 主要培养基

1.6 质粒小量抽提液

1.7 碱裂解法质粒提取试剂及纯化用缓冲液

1.8 SDS-PAGE缓冲液

1.9 Western blotting缓冲液

1.10 其它缓冲液

2 实验方法

2.1 质粒的小量制备

2.2 碱裂解法质粒提取与纯化

2.3 感受态细胞制备

2.4 伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.PrM（PPM）和pPI-2.EGFP.E（PPE）的构建

3 结果

3.1 JEV PrM和E基因的扩增、克隆与鉴定

3.2 JEV-E、PrM基因的序列测定

3.3 伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.E及pPI-2.EGFP.PrM的构建及鉴定

3.4 重组伪狂犬病毒SA215（E）和SA215（F）的构建与筛选

3.5 重组病毒的SA215（E）、（F）PCR鉴定

3.6 重组病毒SA215（E）和SA215（F）的Southern杂交鉴定

3.7 重组病毒SA215（E）及SA215（F）Western-bloting检侧

4.讨论

4.1 乙脑病毒E基因和PrM基因的选择

4.2 伪狂犬病病毒载体的选择

4.3 重组伪狂犬病病毒SA215（E）及（F）的构建

4.4 关于真核转染宿主细胞的选择

4.5 重组伪狂犬病毒SA215（E）和SA215（F）的筛选

4.6 外源基因在伪狂犬病病毒载体中的表达

5 小结

第三章 SA215（E）及SA215（F）部分生物学特性研究

1 材料

1.1 疫苗和病毒

1.2 细胞

1.3 试剂

1.4 实验动物

2 方法

2.1 细胞培养

2.2 在Vero细胞上的致病效应观察

2.3 蚀斑试验

2.4 一步生长曲线测定

2.5 重组病毒与亲本毒株SA215形态学比较

2.6 稳定性试验

2.7 新生仔猪安全试验

2.8 重组病毒对Balb/c小鼠和兔的安全性

2.9 重组病毒对小鼠免疫保护性试验

2.10 重组病毒对兔的免疫保护性试验

2.11 接种SA215（E）、SA215（F）鼠血清JEV中和抗体检测

2.12 外周T淋巴细胞亚群数量的检测

2.13 脾淋巴细胞增殖反应试验

3 结果

3.1 SA215（E）和SA215（F）在Vero细胞上致病变效应过程

3.2 噬斑形态观察

3.3 一步生长曲线

3.4 重组病毒SA215（E）、（F）与亲本毒株SA215形态学比较

3.5 稳定性试验

3.6 安全性试验结果

3.7 重组病毒对伪狂犬病的免疫保护性试验结果

3.8 重组病毒对乙脑病毒的免疫保护性试验结果

3.9 中和试验结果

3.10 免疫小鼠T细胞亚群数量的变化

3.11 免疫小鼠的脾特异性淋巴细胞增值反应检测

4 讨论

4.1 外源基因插入对PRV培养特性的影响

4.2 重组病毒稳定性

4.3 关于SA215（E）及SA215（F）株安全性

4.4 关于重组病毒免疫原性

5 小结

第四章 NS1及NS3原核表达

1 实验材料

1.1 主要仪器

1.2 菌株、载体

1.3 主要药品与试剂

1.4 NS1及NS3引物

1.5 主要溶液的配制

2 实验方法

2.1 JEV细胞培养

2.2 RNA提取

2.3 乙脑病毒NS1、NS3基因的扩增

2.4 JEV NS1和NS3基因的克隆

2.5 重组质粒的鉴定

2.6 pET-32（+）NS1和NS3表达菌株的构建

2.7 重组表达质粒的小量诱导表达

2.8 融合蛋白的Western Blot分析

2.9 重组质粒表达条件的优化

2.10 重组表达蛋白在宿主菌中的分布

2.11 重组表达蛋白NS1的纯化

3 结果

3.1 JEV NS1、NS3基因的扩增、克隆与鉴定

3.2 JEV-NS1、NS3基因的序列测定

3.3 重组表达载体pET-32a（+）NS1和NS3的构建及鉴定

3.4 重组质粒的小量诱导表达

3.5 重组表达蛋白在宿主菌中的分布

3.6 表达产物的Western blot分析

3.7 重组质粒pET-NS1表达条件的优化

3.8 NS1融合蛋白的纯化

4 讨论

4.1 重组蛋白表达载体的选择

4.2 关于包涵体和包涵体溶解

4.3 关于重组蛋白的纯化

5 小结

第五章重组蛋白NS1间接ELISA方法的初步建立

1 材料

1.1 制备抗原所需材料

1.2 试验用血清

1.3 主要仪器设备及耗材

1.4 ELISA试剂和溶液

2 方法

2.1 ELISA抗原的制备

2.2 间接ELISA操作程序

3 结果

3.1 抗原和抗体最佳浓度的确

3.2 最适封闭液的确定

3.3 血清最适结合时间的确定

3.4 酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定

3.5 底物作用时间的确定

3.6 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

3.7 特异性试验

3.8 重复性试验

3.9 试验血清检测结果

4 讨论

4.1 间接ELISA方法在JEV检测诊断中的应用

4.2 包被抗原

4.3 酶标抗体

4.4 特异性和重复性分析

4.5 关于该方法用于鉴别诊断的可行性

5.小结

结论

参考文献

致谢

个人简介

攻读学位期间发表的学术论文

乙型脑炎病毒—伪狂犬病病毒二联基因工程疫苗研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢