论文摘要
研究背景前列腺癌是美国最常见的肿瘤,在癌症引起的死亡中位居第二位。在前列腺癌的发病率一直较低的国家如中国,其发病率也呈快速上升趋势。该病一旦诊断,其主要的治疗方法为手术切除和放射治疗,但这两种方法对于晚期前列腺癌的治疗效果均不佳,因此其长期生存率也是很低的。近年来,越来越多的文献报道,组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor,HDACI）可在体内外抑制肿瘤细胞的增殖,诱导分化和凋亡。丙戊酸（Valproic acid,VPA）作为HDACI类药物,可以诱导肿瘤细胞生长抑制、分化和凋亡,但关于VPA诱导前列腺癌细胞发生自噬性死亡的文献报道较少,在本项研究中,我们拟就VPA诱导前列腺癌PC-3细胞系发生白噬性死亡的过程进行观察,并对其作用机制进行初步探讨,为临床开发治疗前列腺癌的新药物提供理论依据及实验基础。目的对VPA诱导前列腺癌PC-3细胞发生自噬性死亡的过程在体外进行观察和检测,并初步探索自噬与Akt/mTOR信号转导通路的关系,为深入研究VPA抑制前列腺癌细胞生长的作用机制提供进一步理论依据。材料与方法将人前列腺癌PC-3细胞接种于96孔板中,5%CO2、37℃恒温培养,应用5.0 mmol/L VPA进行干预,并设立对照组,作用24h、48h、96h后行CCK-8染色法检测细胞生长情况。本实验分为对照组和VPA 5.0mmol/L组。于细胞对数生长期加入药物VPA,分别培养24h、48h及72h,收集制备标本后行透射电子显微镜观察细胞超微结构（包括自噬体和自噬溶酶体）。PC-3细胞接种于盖玻片置于6孔板中,分组及培养时间同上,常规收集、固定细胞,加入一抗及带FITC荧光标记的二抗制片,应用免疫荧光测定仪观察细胞内荧光的数量及强度。常规细胞培养,分组及药物作用浓度和时间同上,应用Western-blotting检测经VPA处理后PC-3细胞内LC3-Ⅱ、p-Akt蛋白的表达水平。结果经VPA处理后,人前列腺癌PC-3细胞系细胞增殖活性实验组与对照组短期内差别不大,无明显统计学意义（p>0.05）。透射电子显微镜观察可见人前列腺癌PC-3细胞系细胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,实验组自噬体的数量较对照组明显增多,且随VPA作用时间的延长自噬的水平逐渐增强,证明了VPA诱导人前列腺癌PC-3细胞自噬性死亡的存在。经绿色荧光FITC标记的自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ可以清楚显示自噬在细胞中的分布,即可见LC3绿色荧光呈点状散在分布于细胞膜附近,而阴性对照组只有极弱的荧光。随VPA作用时间的延长,人前列腺癌PC-3细胞系细胞自噬特异性相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平明显升高,而p-Akt蛋白的表达水平则明显降低,变化趋势显著,有明显统计学意义（p<0.05）。结论VPA作用人前列腺癌PC-3细胞4天,可诱导前列腺癌PC-3细胞发生自噬,其自噬的程度与药物作用的时间呈正相关,其诱导列腺癌PC-3细胞发生自噬的机制与阻断Akt/mTOR信号转导通路有关。