转SNanog-GFP绵羊成纤维细胞系的建立

论文摘要

自从2006年Yamanaka等人开创了使用多能性因子诱导体细胞使其重编程为多能性干细胞这一重要的研究途径,人们就开始了对体细胞重编程各方面的深入探究,其中一项就是关于体细胞重编程过程中涉及到的多能性基因及其作用机制,比如Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog等。Nanog基因在维持胚胎干细胞多能性和自我更新上具有重要的作用,其在体细胞重编程过程中的意义也是人们一直关心的热点问题。目前多个物种包括人的iPS诱导方法都相继被建立,与其相比,绵羊iPS研究进展相对滞后,尤其很少涉及绵羊内源多能性基因的使用。本研究通过克隆得到绵羊Nanog启动子相关序列,与pAcGFP1-N1载体连接,构建绵羊Nanog启动子带动报告基因GFP表达的真核表达载体,用此载体转染绵羊胚胎成纤维细胞,并用G418进行筛选,从而获得绵羊Nanog-GFP转基因细胞系。本研究为进一步探明Nanog在绵羊体细胞重编程中的作用及完善绵羊体细胞重编程技术奠定了基础。本研究的结果与结论如下:1.我们参照中科院昆明动物所王文教授提供的绵羊Nanog基因启动子理论序列,设计特异性引物对绵羊基因组DNA进行PCR扩增,获得绵羊Nanog基因启动子的核心序列,该序列全长1836bp,与牛的同源性高达92.95%。2.去掉pAcGFP1-N1载体本身的CMV巨噬细胞病毒启动子,与克隆得到的绵羊Nanog启动子序列进行连接,构建得到SNanog-pAcGFP1-N1真核表达载体。3.经检测,SNanog-pAcGFP1-N1真核表达载体在多能性细胞如小鼠胚胎和ES细胞中具有表达活性,而在高度分化的体细胞如绵羊和小鼠皮肤成纤维细胞中不具有表达活性。4.将SNanog-pAcGFP1-N1真核表达载体线性化后采用脂质体法转染绵羊胚胎成纤维细胞,然后用G418筛选转染后的细胞得到阳性细胞。5.设计载体特异性引物对筛选后的阳性细胞的基因组DNA进行PCR扩增,表明SNanog-GFP外源基因被整合入绵羊胚胎成纤维细胞的基因组中。转基因细胞系细胞生物学特征正常,生长状态良好,可以进行常规的传代培养以及冻存复苏。综上所述,我们成功地筛选得到转SNanog-GFP绵羊胚胎成纤维细胞系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 2 绵羊Nanog启动子真核表达载体的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物、细胞及菌株
• 2.1.2 实验所用载体信息
• 2.1.3 主要试剂和药品
• 2.1.4 常用试剂的配制
• 2.1.5 实验仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 绵羊Nanog基因的启动子克隆及序列分析
• 2.2.2 绵羊Nanog基因启动子真核表达载体的构建
• 2.2.3 绵羊Nanog启动子真核表达载体的鉴定
• 2.2.4 绵羊Nanog-GFP真核表达载体表达活性检测
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 绵羊Nanog启动子的扩增
• 2.3.2 绵羊Nanog启动子克隆载体的鉴定
• 2.3.3 绵羊Nanog启动子的序列分析
• 2.3.4 绵羊Nanog启动了真核表达载体的鉴定
• 2.3.5 绵羊Nanog启动子高度分化细胞中表达活性的检测
• 2.3.6 绵羊Nanog启动子在胚胎干细胞中的表达活性检测
• 2.3.7 绵羊Nanog启动子在小鼠早期胚胎中的表达活性检测
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 转SNanog-GFP绵羊成纤维细胞系的构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验细胞
• 3.1.2 实验试剂及设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 绵羊胚胎成纤维细胞的培养
• 3.2.2 G418筛选的预实验
• 3.2.3 绵羊胚胎成纤维细胞的转染
• 3.2.4 转基因绵羊胚胎成纤维细胞系的筛选
• 3.2.5 转绵羊胚胎成纤维细胞系的鉴定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 G418最佳筛选浓度的确定
• 3.3.2 转基因细胞系的细胞生物学特征
• 3.3.3 转基因细胞系的PCR鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢