细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及鉴定

论文摘要

细粒棘球蚴病又称囊型包虫病（Cystic echinococcosis,CE）,是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）幼虫引起的寄生虫病,是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人兽共患寄生虫病,呈全球性分布。目前对人的包虫病治疗以手术治疗为主,药物治疗为辅,但手术对人体损伤大且可能复发,服用阿苯哒唑和甲苯咪唑则可产生严重的不良反应,所以无法从根本上消灭包虫病。由于包虫病发病缓慢,易于传播,至今没有一种有效的预防措施,严重威胁牧区人民的健康和畜牧业发展。因此,对包虫病的早期诊断和免疫预防也就成为当前的研究热点。由于传统的病原学方法,诊断该病较困难,故常用影像学和免疫学方法作为辅助诊断手段,尤其免疫学方法以其费用低廉、操作简便、特异性高而成为目前包虫病诊断中的重要手段。但该病免疫学诊断因缺少标准、特异的抗原而影响了实验的敏感性和结果的判定。因此,有必要寻找新的候选基因,并对其进行克隆、表达、纯化,从而进行免疫学特性及相关功能的初步鉴定,为包虫病的防治奠定基础。硫氧还蛋白过氧化物酶（Thioredoxin peroxidase,TPx）属于过氧化物酶超家族（Prx）中的一员,广泛存在于生物体中,它以硫氧还蛋白作为电子供体去除机体内的活性氧类物质,不仅具有强大的抗氧化功能,而且在细胞分化、凋亡和细胞增殖等方面都具有调节作用。目前,有关线虫和吸虫抗氧化物酶方面的研究已很多,但是绦虫抗氧化酶的研究还较少。1998年,Salinas等研究发现:在体外培养条件下,细粒棘球绦虫的幼虫原头蚴（PSC）可以代谢H2O2,而在其体内检测不到过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,因此推测EgTPx在保护机体免受氧化损伤过程中起着关键的作用,其对于棘球蚴在人和其它中间宿主内脏器官中存活是十分必要的,因而成为寄生虫免疫研究的重点。本研究根据细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）的基因序列[AF478688]设计引物,扩增EgTPx基因,分别构建原核和真核重组质粒,利用大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统分别对其进行表达和鉴定,以期为包虫病分子疫苗的研制提供新的候选基因。研究内容主要包括:细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、原核表达及免疫学特性鉴定;细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定。首先,以细粒棘球绦虫原头蚴的RNA为模板,根据互联网GenBank检索出的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到原核表达载体pET-41b ,转化入大肠杆菌BL21,对重组基因进行DNA测序,利用DNAman、NCBI/BLAST公共数据库对目的基因的同源性进行比较分析正确后进行原核诱导表达,并经亲和层析法纯化重组蛋白（rEgTPx）——EgTPx/GST。结果显示:PCR扩增得到582bp的目的基因,该基因与互联网检索的基因序列同源性为99.83%,氨基酸序列同源性为100%,表达并纯化出rEgTPx,分子量约54KDa。由此,大量制备了重组蛋白rEgTPx,为后续实验提供了抗原物质。其次,用纯化的重组蛋白rEgTPx作为抗原免疫小鼠制备抗血清,通过ELISA及Western blot对重组蛋白rEgTPx的免疫学特性进行初步研究。间接ELISA检测结果表明制备的抗血清能与重组蛋白rEgTPx发生特异性免疫识别,免疫过程中抗体滴度呈现连续动态上升的趋势,其抗血清的效价达到1:25 6000。Western blot结果显示:获得的抗血清能与rEgTPx和天然原头蚴抗原发生特异性反应,表明重组蛋白rEgTPx具有原头蚴天然TPx蛋白的免疫活性,也间接说明rEgTPx可能很好地保持了原头蚴天然TPx的生物学功能表位,有望成为包虫病高效疫苗的候选靶抗原,并为EgTPx免疫诊断提供有效的抗原物质。另外,原核表达系统也能表达出具有活性的EgTPx蛋白,但该类系统缺乏必需的蛋白质翻译后修饰及折叠机制,进而可能影响真核来源的重组产物的生物学活性。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统以其无可比拟的优越性成为近年来发展迅速、应用广泛的真核表达系统。到目前为止,超过500种外源蛋白的基因被克隆至毕赤酵母表达系统中并被成功地表达。因此,本研究利用毕赤酵母表达系统表达EgTPx,以期获得更具天然活性的EgTPx蛋白。首先,从棘球蚴包囊中分离出原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR的方法,获取EgTPx的cDNA片段并克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质pPIC9K-EgTPx,用限制性内切酶Bgl II将其线性化后经电转化法转化毕赤酵母GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA进行PCR鉴定及Mut+表型鉴定;在AOX1启动子调控下,阳性克隆经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后对表达产物进行SDS-PAGE检测和western blot鉴定,结果表明目的蛋白分子量大约为22KDa,具有良好的免疫原性。不同浓度的H202检测其抗氧化活性的实验表明,表达EgTPx的酵母细胞对H202的耐受能力明显高于对照组。本研究在毕赤酵母表达系统中实现了EgTPx的分泌表达,为深入探讨EgTPx的生物学功能研究奠定物质基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述
• 第一章 硫氧还蛋白过氧化物酶（TPx）及其抗氧化作用研究进展
• 1 TPx 基因家族
• 1.1 酿酒酵母的TPx
• 1.2 寄生虫的TPx
• 1.3 哺乳动物TPx
• 1.4 昆虫TPx
• 1.5 植物TPx
• 2 TPx 的抗氧化作用机制
• 3 TPx 的生物学特性
• 3.1 TPx 对过氧化氢和羟自由基的清除作用
• 3.2 TPx 对维持机体氧化还原平衡的作用
• 3.3 TPx 的其它特性
• 4 展望
• 参考文献
• 第二部分 实验内容
• 第二章 细粒棘球绦虫EgTPx 基因的克隆、原核表达、纯化及免疫学特性鉴定
• 1 材料
• 1.1 细粒棘球绦虫原头蚴的收集
• 1.2 质粒与菌种
• 1.3 常用分子克隆试剂
• 1.4 实验动物
• 2 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 细粒棘球绦虫原头蚴（PSC）总RNA 的提取
• 2.3 RT-PCR 扩增
• 2.4 pET-41b- EgTPx 重组质粒的构建及酶切鉴定
• 2.5 pET-41b-EgTPx 在大肠杆菌中的诱导表达和纯化
• 2.6 鼠抗rEgTPx 抗血清的制备
• 2.7 抗体的纯化
• 2.8 原头蚴天然总蛋白的提取
• 2.9 ELISA 法测定抗体水平变化及效价
• 2.10 Western blot 免疫印迹检测
• 3 结果
• 3.1 EgTPx 基因的克隆
• 3.2 原核表达载体的构建及鉴定
• 3.3 目的蛋白的诱导表达及纯化
• 3.4 EL1SA 法测定该抗体效价
• 3.5 重组蛋白的免疫活性鉴定
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 细粒棘球绦虫EgTPx 基因在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定
• 1 材料
• 1.1 细粒棘球绦虫原头蚴的收集
• 1.2 质粒与菌种
• 1.3 工具酶和生化试剂
• 2 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 细粒棘球绦虫原头蚴（PSC）总RNA 的提取
• 2.3 RT-PCR 扩增
• 2.4 pPIC9K- EgTPx 重组质粒的构建及酶切鉴定
• 2.5 酵母的电击转化
• 2.6 G418 筛选高拷贝转化子
• 2.7 PCR 法鉴定转化子
• +表型重组酵母的诱导表达'>2.8 Mut⁺表型重组酵母的诱导表达
• 2.9 表达产物的SDS-PAGE 检测和Western blot 鉴定
• 2.10 表达产物的抗氧化功能检测
• 3 结果
• 3.1 EgTPx 基因的克隆
• 3.2 pPIC9K-EgTPx 的酶切鉴定
• 3.3 pPIC9k-EgTPx 质粒的浓度与纯度
• 3.4 重组质粒的线性化回收
• +表型的鉴定'>3.5 高拷贝转化子的筛选及Mut⁺表型的鉴定
• 3.6 表达产物SDS-PAGE 及Western blot 鉴定结果
• 3.7 抗氧化功能检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 个人简历
• 致谢
• 附录一
• 附录二