p53在青蒿琥酯诱导大鼠原代肝星状细胞凋亡及抑制其增殖中的作用

论文摘要

目的探讨p53在青蒿琥酯抑制大鼠原代肝星状细胞（HSCs）增殖及诱导其凋亡中的作用,初步揭示青蒿琥酯对HSCs的作用机理,为临床应用青蒿琥酯治疗肝纤维化提供实验依据。方法健康Wistar大鼠经25%乌拉坦腹腔注射麻醉后消毒,0.8mg/mL链霉蛋白酶50mL与0.5mg/mL胶原酶50mL灌流消化肝脏,细胞悬液经8%、12%和18%Nycodenz密度梯度离心,于8%与12%的梯度界面获取HSCs,调整细胞密度为5×105/mL,接种于培养瓶中以含20%FBS的DMEM培养。倒置相差显微镜下观察新鲜分离的细胞形态和生长特征,流式细胞术检测细胞纯度。传代细胞制备细胞爬片,以抗desmin/FITC,抗GFAP/TRITC, DAPI染色分别标记结蛋白、胶质纤维酸性蛋白和细胞核进一步鉴定HSCs。分离的大鼠肝星状细胞于培养瓶中原代培养10d,使细胞处于培养活化状态。HSCs分为实验组和对照组,实验组以不同浓度青蒿琥酯（终浓度分别为125、150、175、200、225μmol/L）作用24、48及72h。应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖率,消化法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸（Hyp）浓度,比色法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性,流式细胞术PI单染检测细胞周期,流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染和Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡,Western blotting及RT-PCR观察各组细胞中p53表达的变化。结果（1）肝星状细胞的分离培养与鉴定：倒置相差显微镜观察新分离的HSCs呈球形,折光性强,悬浮于培养液中。培养10d后,HSCs已充分展开,细胞呈星形或多边形,细胞内颗粒明显减少。刚分离出来的HSCs与抗desmin抗体结合,流式细胞仪检测细胞纯度,纯度达95%以上。第二代HSCs抗desmin/FITC,抗GFAP/TRITC染色呈阳性,且阳性细胞数>99%。肝星状细胞生长曲线显示肝星状细胞培养72h后开始增殖,第4、5天进入对数生长期,第6、7天进入平台期。（2）青蒿琥酯对细胞增殖的影响：MTT比色结果显示,不同浓度青蒿琥酯分别作用HSCs24.48、72h,与对照组比较,青蒿琥酯150,175,200,225μmol/L对HSCs的抑制率明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）。各治疗组作用HSCs24和48h时其抑制作用随浓度的增加而增加（P<0.01）,提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈浓度依赖性。175μmol/L组抑制作用随作用时间的增加而增加（P<0.01）,其中72h时,150μmol/L组的抑制率已达92.6%,提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈时间依赖性。（3）细胞培养上清液中羟脯氨酸的检测：青蒿琥酯作用24h后,各浓度组细胞分泌羟脯氨酸水平降低,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）（4）细胞培养上清中LDH的检测：青蒿琥酯作用24h后,各浓度组细胞培养上清中LDH水平较低,与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。（5）青蒿琥酯对HSCs细胞周期的影响：青蒿琥酯175、200μmol/L组G0/G1期细胞所占百分率与对照组比较显著上升（P<0.01）,S期细胞所占百分率显著下降（P<0.05）,G2/M期细胞无明显变化。（6）青蒿琥酯对HSCs凋亡的影响：检测结果发现,随着青蒿琥酯浓度的升高,其引起HSCs凋亡的数量呈现上升趋势,对照组细胞凋亡率为（40.73±0.81）%,给药组（青蒿琥酯浓度分别为150、175、200μmol/L）细胞凋亡率分别为（52.63±0.84）%、（63.9±0.50）%、（66.65±0.99）%,各给药组与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。且随着青蒿琥酯浓度的增加,HSCs的凋亡指数逐渐增加。但无青蒿琥酯作用时,HSCs有自发凋亡。Hoechst33258荧光染色结果显示青蒿琥酯组的细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,而对照组细胞核无凋亡形态学改变。（7） Western blotting及RT-PCR检测p53的表达：青蒿琥酯150、175、200μmol/L分别作用HSCs24h后,Western blotting及RT-PCR检测结果显示,p53表达显著增加,且随着药物浓度的增加而增加。结论（1）大鼠原代肝星状细胞分离培养成功。（2）青蒿琥酯呈剂量和时间依赖性地抑制原代分离培养活化的HSCs增殖,从而使胶原蛋白的产生/分泌减少。（3）青蒿琥酯抑制肝星状细胞增殖的作用机制之一是增加]（?）53mRNA表达和p53水平,从而使细胞周期阻滞在G1期,同时能促进肝星状细胞凋亡,且凋亡占主要部分。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 试验仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 原代肝星状细胞的分离
• 1.2.2 原代肝星状细胞的鉴定
• 1.2.3 肝星状细胞生长曲线的绘制
• 1.2.4 NITT法检测不同浓度的青蒿號醋对肝星状细胞增殖的影响
• 1.2.5 细胞培养上清液中轻脯氧酸的检测
• 1.2.6 细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性的测定
• 1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期一Pi单染色法
• 1.2.8 流式细胞仪检测细胞调亡一Annexin V FITC/Pl双染
• 1.2.9 Hoechst 33258焚光染色检测细胞调亡
• 1.2.10 Western b I ott i ng 检测 p53 表达
• 1.2.11 RT-PCR 检测 p53 mRNA 表达
• 1.3 统计学方法
• 结果
• 2.1 大鼠肝星状细胞的鉴定
• 2.2 肝星状细胞生长曲线的绘制
• 2.3 青蒿琥酯对HSCs增殖的影响
• 2.4 HSCs培养上清液中羟脯氨酸的检测
• 2.5 HSCs培养上清液中乳酸脱氢酶的检测
• 2.6 青蒿琥酯对HSCs细胞周期的影响
• 2.7 青蒿琥酯对HSCs凋亡的影响
• 2.8 Western blotting检测p53的表达
• 2.9 RT-PCR检测P53 mRNA的表达
• 讨论
• 3.1 原代大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定
• 3.2 p53与细胞周期
• 3.3 p53与细胞凋亡
• 3.4 青蒿琥酯对HSCs的作用
• 3.5 不足与展望
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢