论文摘要
研究背景非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合症,包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化,胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病密切相关。随着肥胖和糖尿病的高发,NAFLD现在已成为我国常见的慢性肝病之一,生活水平的提高和饮食结构的改变,NAFLD在我国的发病率逐年上升,严重危害人民的健康。有关NAFLD的病因学、预防和治疗已经成为目前的研究热点。目前NAFLD的发病机制尚未完全明确,其中脂代谢异常是NAFLD发生的最主要机制。脂滴包被蛋白（Perilipin）是脂肪细胞内脂滴表面含量最多的一种可磷酸化蛋白,在低磷酸化水平可保护甘油三酯免受水解,在高磷酸化水平可促进甘油三酯高效水解。脂肪分化相关蛋白（adipocyte differentiation-related protein,ADRP）是细胞内脂肪积聚的一个特异指标,不仅参与巨噬细胞中脂质的代谢,也参与肺泡Ⅱ型细胞与纤维母细胞间的脂质转移,并具有保护细胞内甘油三酯不被水解的屏障功能,并促进细胞对长链脂肪酸的摄取,从而提示Perilipin和ADRP基因在调节细胞脂滴代谢的各个环节中发挥着重要的作用,是影响脂代谢过程的重要因素。目前有关Perilipin和ADRP参与NAFLD发生发展的研究鲜见文献报道,亦不清楚其在脂滴合成过程中的确切作用。因此,本实验采用高脂诱导的方法建立NAFLD模型大鼠,并采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）和免疫印迹法（Western blotting,WB）观察NAFLD大鼠肝组织Perilipin和ADRP的表达状况,旨在探讨脂代谢相关基因Perilipin和ADRP在NAFLD发生机制中的作用,为NAFLD的早期防治提供一个新的治疗靶点。目的研究NAFLD模型大鼠肝组织中的与脂代谢密切相关的Perilipin和ADRP基因在mRNA水平和蛋白水平表达的变化,探讨它们在NAFLD发病机制中的作用和意义。方法1. 48只雄性Wistar大鼠,随机分为2组:正常饮食对照组和NAFLD模型组,正常饮食对照组24只以普通饲料喂养,NAFLD模型组中24只大鼠以高脂饲料喂养建立NAFLD模型大鼠。每组设立4、8和12周3个时相点进行观察（各时相点8只大鼠）。肝组织切片行HE染色于光镜下观察肝脏病理学改变;采用生化试剂盒检测大鼠血浆游离脂肪酸（free fatty acids,FFA）和甘油三酯（Triglyceride,TG）、血清丙氨酸转氨酶（alanine transaminase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）的水平。采用RT-PCR技术检测Perilipin和ADRP基因各组肝组织中mRNA水平;采用WB检测Perilipin和ADRP基因在各组肝组织的蛋白水平;采用免疫组化染色技术研究Perilipin和ADRP蛋白在各组大鼠肝组织的分布和定位。结果1、各组大鼠肝脏病理学改变在NAFLD组,随造模时间延长,其肝组织脂变程度越加严重。第4周光镜可见肝小叶结构稍显紊乱,肝细胞索欠清晰,部分肝细胞胞浆疏松,有少量脂滴存在;在第8周可见肝小叶结构紊乱,肝细胞索模糊欠清晰,肝细胞明显浊肿,大多数肝细胞内中可见脂滴;在12周可观察到肝细胞肿胀,肝细胞内有较多脂滴存在,汇管区可见少许炎细胞浸润。在上述各时相点,正常对照组大鼠肝组织肝小叶结构清晰,肝细胞索完整,肝窦无扩张。2、各组大鼠血浆FFA、TG和血清ALT、AST水平变化在NAFLD组,随造模时间的延长,其血浆FFA、TG和血清ALT、AST的水平呈增高趋势,且各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）。与正常对照组各时相点（4周、8周、12周）比较,NAFLD组血浆FFA、TG和血清ALT、AST浓度均显著升高（P<0.01）。在正常对照组血浆FFA、TG和血清ALT、AST的水平无明显变化。3、各组大鼠肝组织Perilipin和ADRP免疫组化染色Perilipin表达的阳性细胞均主要位于肝细胞胞膜,阳性颜色均呈棕褐色、淡黄色。在NAFLD组,随造模时间的延长,Perilipin阳性细胞数减少,阳性着色渐淡,且在各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）,与正常对照组各时相点比较,NAFLD组Perilipin的积分光密度（integrated optical density,IOD）明显降低（P<0.01）,在正常对照组Perilipin阳性细胞染色分别为棕褐色。而ADRP表达的阳性细胞同样主要位于肝细胞胞膜,阳性颜色均呈淡黄色、棕褐色。在NAFLD组,随造模时间的延长,ADRP阳性细胞数增多,阳性着色增强,且在各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）,与正常对照组各时相点比较,NAFLD组ADRP的IOD值则明显增高（P<0.01）,在正常对照组ADRP阳性细胞染色分别为淡黄色。4、各组大鼠肝组织Perilipin-mRNA和ADRP-mRNA水平在NAFLD组,随造模时间的延长,Perilipin-mRNA水平（Perilipin/β-actin）呈降低趋势,而ADRP-mRNA水平（ADRP/β-actin）呈增加趋势,且它们在各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）。与正常对照组各时相点比较,NAFLD组IODPerilipin/IODβ-actin值明显降低（P<0.01）,而IODADRP/IODβ-actin值则明显增高（P<0.01）。在正常对照组Perilipin-mRNA和ADRP-mRNA水平无明显变化。5、各组肝组织Perilipin和ADRP蛋白水平在NAFLD组,随造模时间的延长,Perilipin蛋白水平呈降低趋势,而ADRP蛋白水平呈增加趋势,且它们在各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）。与正常对照组各时相点比较,NAFLD组Perilipin的IOD值明显降低（P<0.01）,而ADRP的IOD值则明显增高（P<0.01）。在正常对照组Perilipin和ADRP蛋白水平无明显变化。6、各组大鼠肝组织Perilipin、ADRP表达与FFA、TG的相关性在各个时相点,NAFLD组Perilipin-mRNA的水平与FFA、TG呈明显负相关（相关系数r值分别为-0.748、-0.719,P<0.01）,其Perilipin蛋白与FFA、TG亦呈显著负相关（r分别为-0.698,-0.666,P<0.01）。NAFLD组ADRP-mRNA的水平与FFA、TG呈显著正相关（r分别为0.648,0.697,P<0.01）,其ADRP蛋白水平与FFA、TG也呈显著正相关（r分别为0.715,0.703,P<0.01）。7、各组大鼠肝组织SOD、MDA变化在NAFLD组,随造模时间增加,其肝组织SOD活性呈降低趋势,且各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）,与正常对照组各时相点的SOD值比较,NAFLD组的SOD值明显降低（P<0.01）。在NAFLD组,随造模时间增加,其肝组织MDA含量增加更加显著,且各时相点进行组内比较,差异非常显著有统计学意义（P<0.01）,与正常对照组各时相点的MDA值比较,NAFLD组的MDA值明显升高（P<0.01）。在正常对照组SOD和MDA水平无显著变化。结论1.在NAFLD模型大鼠,其脂代谢相关基因Perilipin、ADRP在肝组织中的表达与FFA、TG存在显著相关性,提示Perilipin、ADRP的异常表达与肝组织生化指标的紊乱密切相关,相互协同,共同促成了NAFLD的发生;2.在NAFLD模型大鼠,其Perilipin表达水平明显的降低,而ADRP的水平则显著增高,提示Perilipin、ADRP在NAFLD发生发展中可能有重要的作用。
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标签：非酒精性脂肪性肝病论文; 游离脂肪酸论文; 甘油三酯论文;