骨肉瘤患者组织中环氧合酶-2水平研究

曹欣宇1、2张秋林1通讯作者

（1第二军医大学附属长海医院上海200433;

2上海市第七人民医院上海200137）

【摘要】目的：研究骨肉瘤患者癌肿组织中COX-2的mRNA表达水平及蛋白表达水平，并研究它们与患者临床特征之间的关系。方法：本研究采用病例对照设计，同时通过实时定量逆转录-聚合酶链反应方法，比较40例骨肉瘤患者癌肿组织中COX-2表达水平与40例健康骨组织之间是否有差异。结果：骨肉瘤组织中COX-2mRNA表达水平显著高于对照。COX-2水平与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，肿瘤分化程度低、有淋巴结转移的患者癌肿组织中的COX-2mRNA水平升高。结论：骨肉瘤组织中COX-2mRNA表达水平升高，且与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关。

【关键词】骨肉瘤；环氧合酶-2；肿瘤组织

【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)10-0125-02

骨肉瘤是目前最为常见的原发性恶性骨肿瘤，可以发生于任何年龄，尤其是青少年，恶性程度及转移率高，多发于骨骼增长期，预后很差。到目前为止，骨肉瘤的机制仍不明确。近年来，研究者们发现环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)与多种肿瘤的生长、代谢和预后密切相关。研究显示COX-2的激活能促进血管新生，肿瘤组织浸润和转移，对抗细胞的凋亡。其在骨肉瘤的病理生理机制中的作用也越来越受到重视［1］。然而到目前为止关于其与肿瘤的临床特征关系却不一致。本研究拟通过实时定量PCR手段，研究骨肉瘤患者癌肿组织中COX-2的mRNA表达水平及蛋白表达水平，并研究它们与患者临床特征之间的关系。

1资料与方法

11一般资料

111患者组:同第一部分，骨肉瘤患者来自2006年到2012年期间于上海第二军医大学附属长海医院及上海市第七人民医院住院患者。所有病例均签署知情同意书，且术前均未接受放化疗，术后病理检验均证实为骨肉瘤。

112对照组:同第一部分，正常骨组织为对照组，均来源于上海第二军医大学附属长海医院及上海市第七人民医院手术治疗的骨折患者，并签署知情同意书。

共入组骨肉瘤患者40例，其中男24例，女16例，年龄15～42岁，平均23±58岁。其中成骨肉瘤28例，软骨肉瘤l2例；低分化16例，高分化24例；有淋巴结转移17例，无淋巴结转移23例。发病部位：股骨远端15例、股骨近端2例、胫骨近端15例、肱骨近端6例、腓骨近端2例。

正常骨组织为对照组，共40例，年龄、性别匹配（P>005）。其中男24例，女16例，年龄14～42岁，平均（23±67）岁。

12方法

121标本处理及总RNA的抽提:术中切除原发灶后即刻取癌肿组织标本，经09％的氯化钠溶液冲洗后液氮中备用，后转入-80℃冰箱保存，行实时定量PCR。取1~10mg组织样本加入流式管中，加入1mlTrizol(购自Invitrogen公司)，匀浆后以1500rpm离心5min，4℃离心，收集上清，补加Trizol至1ml。并按实验步骤提取总RNA。

122COX-2组织mRNA水平测定:使用TaqMan.MGB探针法在384孔ABIPrism7900序列检测系统（AppliedBiosystems,CA）上进行荧光实时定量PCR扩增，分析COX-2表达水平。用管家基因GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,购于AppliedBiosystems,CA,USA）作为内对照基因，来标化目标基因的表达水平。每个样本的目标基因和内对照GAPDH基因均重复3次。

123数据处理及统计分析：RT-qPCR测定表达量采用比较CT值的方法（ComparativeCtMethod）［2］进行相对定量。One-sampleKolmogorov-Smirnovtest进行正态分布检验；组间样本的年龄和性别构成的比较分别采用t检验和卡方检验；组间COX-2基因相对表达量的比较使用独立样本t检验。所有统计检验均为双侧检验，显著性水平为α=005。

3结果

31骨肉瘤组织中COX-2的相对表达量:骨肉瘤组织中COX-2相对表达量为（009±001），健康对照组COX-2相对表达量为（001±0003），骨肉瘤患者癌肿组织COX-2相对表达量显著高于对照组COX-2相对表达量（t=384,df=78,P＜0001）（图1）。

32骨肉瘤患者不同临床特征之间癌肿组织COX-2表达量的差异

成骨肉瘤组为（008±001），软骨肉瘤组为（011±002），两组之间无统计学差异（t=163,df=38,p=011）；高分化组为（015±003），低分化组（007±001），COX-2蛋白表达显著高于高分化组（t=277,df=38,p=0009）；有淋巴结转移组为为（013±002），无淋巴结转移组为007±001，有淋巴结转移组COX-2蛋白表达显著高于无淋巴结转移组（t=248,df=38,p=002）（表1）。

组织中COX-2相对表达量与骨肉瘤组织类型无关(P>005)、与分化程度及淋巴结转移相关(P<005)，见表1。

4讨论

到目前为止，骨肉瘤的机制仍不明确。近年来，研究者们发现环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)与多种肿瘤的生长、代谢和预后密切相关［3］。Dickens等人对横纹肌肉瘤（RMS），骨肉瘤（OS），尤文氏肉瘤（EWS）样本的COX-2表达的免疫组化分析，以及利用基因芯片分析，结果显示828％肿瘤的免疫组化检测出COX-2的表达，881％基因芯片检测出COX-2，且骨肉瘤有COX-2表达增加的趋势，COX2在肉瘤中呈现高表达［4］。后来Dickens等又对45例骨肉瘤患者组织活检，结果58％的骨肉瘤患者组织中COX-2表达升高，并且骨肉瘤的转移及癌肿浸润程度与COX-2密切相关［5］。其后，Mullins等人通过对44例狗骨肉瘤模型研究也发现,773％狗骨肉瘤模型组织中COX-2表达阳性，而且COX-2表达的强弱与狗存活的时间之间密切相关：无COX-2表达的存活423天，COX-2弱表达的存活399天，COX-2适度表达的存活370天，COX-2强表达的存活86天，这些提示了COX-2对骨肉瘤的发生、发展、转移及预后都有着重要的作用［6］。另外Naruse等人研究还发现，美洛昔康（Meloxicam）能抑制骨肉瘤的生长、侵袭和代谢，但这些作用均与抑制COX-2密切相关［7］。

本研究显示骨肉瘤组织COX-2水平上调与国内外大部分研究一致。且发现COX-2表达与淋巴转移相关，这也提示了其高表达可能会影响骨肉瘤患者的预后。与国外大部分研究结果相似。

COX-2参与骨肉瘤发生发展机制到目前为止还不明确，很可能与它能刺激细胞增殖、诱导肿瘤血管形成、抑制细胞凋亡及机体免疫反应、促进肿瘤浸润和转移等作用密切相关。但通过本研究提示COX-2参与了骨肉瘤的病理生理机制。COX-2水平与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，肿瘤分化程度低、有淋巴结转移的患者癌肿组织中的COX-2mRNA及蛋白表达水平升高。参考文献

［1］WiontzekM,MatziolisG,SchuchmannS,etal.Effectsofdexamethasoneandcelecoxiboncalciumhomeostasisandexpressionofcyclooxygenase-2mRNAinMG-63humanosteosarcomacells.ClinExpRheumatol.2006,24(4):36672

［2］CuiDH,JiangKD,JiangSD,etal.Thetumorsuppressoradenomatouspolyposiscoligeneisassociatedwithsusceptibilitytoschizophrenia.MolPsychiatry.2005,10(7):669677

［3］欧阳振,王栓科,康学文.环氧化酶一2与骨肉瘤［J］.国际骨科学杂志,2006,27(6):347349

［4］DickensDS,KozielskiR,KhanJ,ForusA,etal.Cyclooxygenase-2expressioninpediatricsarcomas.PediatrDevPathol.2002,5:35664

［5］DickensDS,KozielskiR,LeaveyPJ,TimmonsC,CripeTP.Cyclooxygenase-2expressiondoesnotcorrelatewithoutcomeinosteosarcomaorrhabdomyosarcoma.PediatrHematolOncol.2003,25:282

［6］MullinsMN,LanaSE,DernellWS,etalc.Cyclooxygenase-2expressionincanineappendicularosteosarcomas.JVetInternMed.2004,18(6):859

［7］NaruseT,NishidaY,HosonoK,etalN.Meloxicaminhibitsosteosarcomagrowth,invasivenessandmetastasisbyCOX-2-dependentandindependentroutes.Carcinogenesis.2006,27:584

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