利用cDNA-AFLP技术分离木薯干旱胁迫响应相关基因

论文摘要

在干旱、盐、极端温度、化学毒害和氧化胁迫等对植物生长的不利因素中,干旱是所有非生物胁迫中对植物生长影响最大的。木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物,与马铃薯、甘薯并称为世界三大薯类,是全球第六大粮食作物。木薯具备热带作物典型的高光效、高淀粉产量、抗旱、耐瘠薄等特性,是一个抗旱能力突出的作物。目前,对木薯逆境生理已有一定的研究,本研究团队也预测了一些与干旱胁迫相关的miRNA,但在木薯抗旱性的大部份资料仍然是描述性的,木薯耐/抗旱的分子机理尚未被阐明。本研究对抗旱能力较强的SC124进行了cDNA-AFLP分析,并鉴定了木薯在干旱胁迫的不同处理时间下的特异表达基因。主要研究结果如下：1、对木薯SC124品种进行了干旱胁迫处理和对照处理,对4个胁迫处理时间点和一个对照处理时间点的功能叶样品进行了总RNA的提取。2、使用EcoR I和Mse I限制酶组合,共采用了128对引物组合对SC124品种的4个干旱胁迫时间点进行了cDNA-AFLP分析,从3500个左右有效扩增的基因片段中,得到了117个干旱胁迫差异表达的转录获得片段（TDF）。3、将cDNA-AFLP的差异表达带型分为了四种类型,测序成功的117条序列在四种带型中的分布为：上调表达（Ⅰ型）49条占测序总数的41.88%,下调表达（Ⅱ型）22条占测序总数的18.80%,先上调后下调表达（Ⅲ型）26条占测序总数的22.22%,先下调后上调表达（Ⅳ型）20条占测序总数的17.09%。4、对测序结果进行NCBI blastx比对分析,117条序列中的8条无同源序列信息,109条有同源性较高的基因,其中62条的同源基因有功能注释,47条为无功能注释的预测基因或蛋白。按功能将有基因功能注释的62条TDFs分为转录因子、能量代谢、糖类代谢、脂类代谢、氨基酸代谢、信号转导、转移运输、遗传信息处理、多肽类合成与代谢7大类。5、共对19个TDFs进行了RT-PCR和荧光定量PCR验证,12个分析结果与cDNA-AFLP结果一致。其中9个TDFs分别为能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、信号转导、多肽合成和代谢功能类的基因。另外3个TDFs无功能注释,可能为未报道的新基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 干旱胁迫与植物抗旱
• 1.1.1 干旱胁迫对植物的影响
• 1.1.1.1 生长抑制
• 1.1.1.2 生物量的积累与分配
• 1.1.1.3 气孔行为和光合作用
• 1.1.1.4 活性氧氧化伤害
• 1.1.1.5 呼吸作用异常
• 1.1.1.6 物质代谢失调
• 1.1.1.7 能量代谢失调
• 1.1.2 植物干旱胁迫适应相关研究
• 1.1.2.1 抗旱相关转录因子
• 1.1.2.2 胁迫信号转导相关蛋白激酶
• 1.1.2.3 功能蛋白和渗透调节因子
• 1.2 木薯概述
• 1.2.1 木薯概况
• 1.2.2 木薯抗旱研究进展
• 1.3 cDNA-AFLP技术
• 1.3.1 cDNA-AFLP技术简介
• 1.3.2 cDNA-AFLP技术的应用
• 1.4 主要研究内容
• 1.5 目的与意义
• 1.6 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 仪器设备
• 2.2 实验材料培养与处理
• 2.3 cDNA-AFLP分析
• 2.3.1 总RNA的提取与检测
• 2.3.1.1 器皿处理
• 2.3.1.2 木薯叶片总RNA提取
• 2.3.2 DNA酶消化
• 2.3.2.1 DNA酶消化
• 2.3.2.2 RNA质量检测
• 2.3.3 双链cDNA的合成
• 2.3.3.1 第一链cDNA的合成
• 2.3.3.2 双链cDNA的合成
• 2.3.3.3 双链cDNA的纯化
• 2.3.4 双链cDNA的限制性双酶切
• 2.3.5 双链cDNA的限制性双酶切产物与接头连接
• 2.3.5.1 接头的退火
• 2.3.5.2 接头的连接
• 2.3.6 cDNA-AFLP预扩增
• 2.3.7 cDNA-AFLP选择性扩增
• 2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色
• 2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 2.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.3 凝胶银染显色
• 2.5 多态性片段的回收、纯化、测序
• 2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶差异条带DNA回收
• 2.5.1.1 煮沸法
• 2.5.1.2 直取法
• 2.5.2 回收条带的二次PCR扩增
• 2.5.3 二次扩增产物的纯化
• 2.5.4 DNA的克隆
• 2.5.5 转化
• 2.5.6 阳性克隆鉴定
• 2.5.7 测序
• 2.6 差异表达序列的生物信息学分析
• 2.7 两步法RT-PCR反应
• 2.8 荧光定量PCR验证
• 2.8.1 标准曲线的制作
• 2.8.2 相对定量PCR反应
• 3 结果与分析
• 3.1 木薯干旱胁迫处理结果
• 3.1.1 干旱胁迫处理方法
• 3.1.2 各采样时间点的植株表型
• 3.2 总RNA的提取
• 3.3 双链cDNA的合成
• 3.4 cDNA-AFLP结果
• 3.4.1 预扩增结果检测
• 3.4.2 选择性扩增结果检测
• 3.5 特异表达基因片段的回收及二次PCR扩增
• 3.6 特异表达基因片段的克隆
• 3.7 测序结果分析
• 3.8 应答干旱胁迫逆境特异表达基因的功能分组
• 3.9 RT-PCR结果分析
• 3.10 荧光定量PCR结果分析
• 4 讨论
• 4.1 干旱胁迫样品的处理和材料的选择
• 4.2 关于cDNA-AFLP实验体系
• 4.2.1 木薯RNA的提取
• 4.2.2 关于酶切
• 4.2.3 关于DNA片段分析
• 4.2.4 聚丙烯酰胺凝胶DNA回收
• 4.2.5 DNA片段克隆方法比较
• 4.2.6 荧光定量PCR引物的设计
• 4.3 木薯干旱胁迫响应差异表达条带的分析
• 4.4 木薯干旱胁迫响应相关基因的生物学意义
• 4.4.1 Ⅰ型表达的TDFs
• 4.4.2 Ⅱ型表达的TDFs
• 4.4.3 Ⅲ型表达的TDFs
• 4.4.4 Ⅳ型表达的TDFs
• 4.5 下一步工作
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录一:缩略词表（Abbreviation）
• 附录二:相关试剂的配制
• 附录三:18对TDFs的荧光定量引物
• 附录四:18个TDFs的荧光定量PCR分析结果
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢