酶解鹿茸血疏水性肽的分离及活性研究

论文摘要

鹿茸血是一种传统名贵中药,含有大量蛋白质及人体必需氨基酸。研究表明,鹿茸血具有多种生物效用,其生物活性与蛋白质结构及氨基酸组成密切相关。本文以鹿茸血为原料进行酶解,研究了酶解产物的抗氧化活性和血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme, ACE）抑制活性;通过大孔吸附树脂分级洗脱研究了酶解产物的疏水性与抗氧化及ACE抑制活性的关系;通过活性炭色谱法、反相高效液相及液相-质谱联用等方法获得了具有较高抗氧化和ACE抑制活性的组分。论文主要研究结论如下:首先采用木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和Alcalase蛋白酶分别对鹿茸血进行酶解:Alcalase蛋白酶水解3 h的产物具有最高的ACE抑制活性,其ACE抑制率为90.63%;酸性蛋白酶水解3h的产物具有最高二苯代苦味肼自由基（DPPH·）清除率,为23.10%;木瓜蛋白酶水解5 h的产物羟自由基（OH·）清除率最高,为96.7%。对水解产物的水解度、抗氧化及ACE抑制活性进行统计分析,结果表明对于本实验,水解产物抗氧化活性与水解度显著正相关,而ACE抑制率与DPPH·清除率显著正相关。采用DA201-C大孔吸附树脂对鹿茸血酶解物进行疏水性分离,采用不同浓度乙醇进行梯度洗脱。结果表明组分疏水性值随乙醇浓度的升高而升高,75%乙醇洗脱组分具有最高的疏水性值。统计分析表明,对于本实验ACE抑制率与疏水性值显著相关;DPPH·清除率与疏水性值无显著相关;芳香族氨基酸含量对抗氧化和ACE抑制活性有重要影响。采用截留分子量为6000Da的中空纤维柱对75%乙醇洗脱组分进行超滤,未能明显提高产物活性。采用活性炭色谱法对鹿茸血水解物进行分离以获得高疏水性值、高芳香族氨基酸含量的组分。动态吸附实验发现,pH值、上样流速和上样浓度都会影响活性炭柱的吸附量。在pH值为4、流速为0.5 BV/h、浓度为10 mg/mL的条件下上样,采用六种不同的洗脱剂进行洗脱,并对洗脱组分进行活性测定。结果显示无水乙醇和5%乙酸的混合溶液洗脱组分具有较高的抗氧化活性和ACE抑制活性,该组分疏水性值和芳香族氨基酸含量明显增加。采用半制备RP-HPLC分离上述洗脱组分,得到从R-1到R-11共11个组分,其中R-9具有最高的羟自由基清除率,R-11具有最高的DPPH自由基清除率和较高的ACE抑制率。液质联用分析组分R-9和R-11,得到三条多肽序列,分别为NSAW、YDQW、YDAW。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 自由基与氧化应激
• 1.2 抗氧化与高血压
• 1.3 肽的抗氧化作用机理
• 1.3.1 直接与活泼自由基反应
• 1.3.2 具有供氢、供电子能力
• 1.3.3 作用于与自由基有关的酶
• 1.3.4 与诱导氧化的过渡金属螯合
• 1.4 疏水性氨基酸与ACE 抑制肽
• 1.5 ACE 与ACE 抑制肽
• 1.5.1 ACE 对血压的调节作用
• 1.5.2 ACE 抑制肽的结构与活性关系
• 1.6 课题背景与意义
• 第二章 酶解鹿茸血抗氧化与ACE 抑制活性的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 材料与主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蛋白质含量的测定
• 2.3.2 酶活的测定
• 2.3.3 鹿茸血的酶法水解
• 2.3.4 水解度的测定
• 2.3.5 DPPH·清除率的测定
• 2.3.6 ·OH 清除率的测定
• 2.3.7 ACE 抑制活性的测定
• 2.3.8 统计分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 鹿茸血的酶解
• 2.4.2 水解产物的ACE 抑制活性
• 2.4.3 水解产物的·OH 清除活性
• 2.4.4 水解产物的DPPH·清除活性
• 2.4.5 水解产物的水解度与抗氧化活性的关系
• 2.4.6 水解产物的ACE 抑制活性与抗氧化活性的关系
• 2.5 本章小结
• 第三章 鹿茸血肽疏水性与抗氧化及ACE 抑制活性的关系
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 鹿茸血酶解物的制备
• 3.3.2 DA201-C 大孔树脂的预处理
• 3.3.3 DA201-C 大孔树脂的静态吸附实验
• 3.3.4 DA201-C 大孔树脂动态吸附实验
• 3.3.4.1 不同流速对DA201-C 大孔树脂吸附性能的影响
• 3.3.4.2 不同样品浓度对DA201-C 大孔树脂吸附性能的影响
• 3.3.5 鹿茸性肽的大孔树脂动态乙醇分级洗脱
• 3.3.6 乙醇分级洗脱组分的超滤处理
• 3.3.7 DPPH·清除率的测定
• 3.3.8 ACE 抑制活性的测定
• 3.3.9 氨基酸组成分析
• 3.3.10 蛋白质或多肽疏水值的计算
• 3.3.11 统计分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 几种常见的大孔吸附树脂
• 3.4.2 DA201-C 大孔树脂静态吸附实验
• 3.4.3 DA201-C 大孔树脂动态吸附实验
• 3.4.3.1 不同流速对DA201-C 大孔树脂吸附性能的影响
• 3.4.3.2 不同上样浓度对DA201-C 大孔树脂吸附性能的影响
• 3.4.4 DA201-C 大孔树脂分级洗脱及氨基酸组成分析
• 3.4.5 分级洗脱组分疏水性与抗氧化和ACE 抑制活性的关系
• 3.4.6 超滤处理对组分抗氧化和ACE 抑制活性的影响
• 3.5 本章小结
• 第四章 活性炭色谱法分离鹿茸血肽及结构鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 材料与主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 鹿茸血酶解物的制备
• 4.3.2 活性炭色谱法分离鹿茸血肽
• 4.3.2.1 活性炭预处理
• 4.3.2.2 活性炭动态吸附和解吸实验
• 4.3.2.3 不同洗脱剂洗脱效果比较
• 4.3.2.4 抗氧化和ACE 抑制活性组分氨基酸分析
• 4.3.3 半制备RP-HPLC 分离制备抗氧化和ACE 抑制活性组分
• 4.3.4 液质联用分析抗氧化和ACE 抑制活性组分
• 4.3.5 DPPH·清除率的测定
• 4.3.6 ACE 抑制活性的测定
• 4.3.7 蛋白质或多肽疏水值的计算
• 4.3.8 ·OH 清除率的测定
• 4.3.9 蛋白质含量的测定
• 4.3.10 核酸含量的测定
• 4.3.11 统计分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 活性炭动态吸附和解吸实验
• 4.4.1.1 pH 值对活性炭吸附性能的影响
• 4.4.1.2 上样流速对活性炭吸附性能的影响
• 4.4.1.3 上样浓度对活性炭吸附性能的影响
• 4.4.2 不同洗脱剂洗脱效果比较
• 4.4.3 活性炭分离抗氧化和ACE 抑制活性组分的氨基酸组成
• 4.4.4 半制备RP-HPLC 分离
• 4.4.5 液质联用分离组分
• 4.5 本章小结
• 论文主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文