抗真菌活性菌株的筛选及三株内生菌次级代谢产物的初步研究

论文摘要

真菌感染是当前临床常见的疾病,而耐药菌株的出现,则是对深度真菌感染治疗的更大挑战。因此,如何治疗真菌感染成为人们关注的热点和难点问题,迫切需要寻找敏感、广谱和安全的抗深部真菌感染的新药。海洋真菌和植物内生菌由于其生存环境的特殊性,可以产生结构独特,骨架新颖的次级代谢产物,是研究开发抗真菌新药的重要来源。本文从海洋真菌和植物内生菌中筛选抗真菌活性物质产生菌,并对高活性菌株的次级代谢产物进行了初步研究,旨在发掘具有潜在应用前景的抗菌活性菌株,为开发抗真菌新药奠定基础。以2株白假丝酵母（Candida albicans）为指示菌,采用牛津杯法对228株海洋真菌和植物内生菌的抗真菌活性进行初筛,发现有63株具有活性,占总供筛菌株的28%。采用微量稀释法和芽管抑制模型进一步对这些活性菌株进行复筛,从中筛出15株具有较高活性的菌株(MIC50≤25μg/mL)和22株具有抑制芽管形成作用的菌株(IC50≤25μg/mL)。对3株具有抗真菌活性的植物内生菌（植物内生放线菌AF349、植物内生真菌AF274和海藻内生真菌AF044）的次级代谢产物进行了初步研究,从其发酵产物中分离鉴定了DZ-3、DZ-6、DZ-7、DZ-9、DZ-17、DZ-20、DZ-22、DZ-23、DZ-24等9个化合物,其中化合物DZ-6、DZ-7和DZ-23为新化合物,化合物DZ-17和DZ-24是首次从自然界中分离得到。对分离到的部分化合物进行了生物活性检测,结果表明,化合物DZ-3具有较强的抗真菌活性,对白假丝酵母ATCC 10231和AS 2.538的MIC均为8μg/mL;抑制芽管形成的MTC分别为4μg/mL和8μg/mL,IC50分别为2.21μg/mL和IC50为5.03μg/mL;对木霉（Trichoderma sp.）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani Kuhn）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）、葫芦科刺盘孢（Colletotrichum lagenarium（Passerini）Ellis et Halsted）、寄生疫霉（Phytophthora parasitica Destur）、小麦纹枯病菌（Pellicularia gramineum Ikataet Matsumura）等多种植物病原菌也具有较强的抑制活性。采用流式细胞术分析显示,化合物DZ-3可作用于白色假丝酵母的细胞膜,使其细胞膜损伤,以浓度为8μg/mL处理48h,对白假丝酵母ATCC 10231和AS 2.538细胞膜的损伤率分别为64%和80%。对麻黄内生真菌AF274、海藻内生真菌AF044和番荔枝内生放线菌AF349菌株进行了初步分类,根据菌株的形态特征,将菌株AF274和AF044初步鉴定为镰刀菌（Fusarium sp.）和曲霉菌（Aspergillus sp.）;根据菌株AF349的形态特征及16SrDNA序列比对结果,将其鉴定为小链霉菌（Streptomycesparvus）。本文的结果表明,海洋真菌和植物内生菌中蕴藏着丰富的抗真菌活性物质产生菌,是发掘抗真菌新药的宝贵资源。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 常用英文缩写词
• 1 前言
• 1.1 抗真菌剂主要作用靶点及其常见抑制剂
• 1.1.1 细胞壁抑制剂
• 1.1.2 细胞膜抑制剂
• 1.1.3 蛋白质合成抑制剂
• 1.1.4 电子传递抑制剂
• 1.1.5 核酸合成抑制剂
• 1.1.6 其它
• 1.1.7 常用抗真菌药物现存问题
• 1.2 微生物次级代谢产物的研究进展
• 1.2.1 海洋微生物次级代谢产物的研究进展
• 1.2.2 植物内生菌及其次级代谢产物研究概况
• 1.3 本课题研究目的、内容和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 指示菌
• 2.1.3 常用培养基
• 2.1.4 抗真菌试剂
• 2.1.5 常用试剂
• 2.1.6 主要试剂及耗材
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株观察
• 2.2.2 样品的制备
• 2.2.3 抗真菌活性测定
• 2.2.4 天然产物的分离纯化
• 2.2.5 化合物的结构测定
• 3 结果与分析
• 3.1 抗真菌活性物质产生菌的筛选
• 3.1.1 活性菌株的初筛
• 3.1.2 活性菌株的复筛
• 3.2 菌株的鉴定
• 3.2.1 菌株AF274的初步鉴定
• 3.2.2 菌株AF044的初步鉴定
• 3.2.3 菌株AF349的鉴定
• 3.3 菌株AF274活性代谢产物的研究
• 3.3.1 菌株的发酵及发酵产物的提取
• 3.3.2 发酵产物的分离纯化
• 3.3.3 化合物DZ-3的结构解析
• 3.4 菌株AF044次级代谢产物的研究
• 3.4.1 菌株的发酵及发酵产物的提取
• 3.4.2 发酵产物的分离纯化
• 3.4.3 化合物的结构解析
• 3.5 菌株AF349次级代谢产物的研究
• 3.5.1 发酵培养基的选择
• 3.5.2 菌株的发酵及发酵产物的提取
• 3.5.3 发酵产物的分离纯化
• 3.5.4 化合物的结构解析
• 3.6 化合物的生物活性研究
• 3.6.1 化合物DZ-3
• 3.6.2 化合物DZ-9
• 3.6.3 化合物DZ-6和DZ-7
• 4 讨论与结论
• 4.1 海洋真菌及植物内生真菌的抗真菌活性
• 4.2 抗真菌活性筛选方法
• 4.3 天然产物分离策略
• 4.4 植物内生菌的次级代谢产物及其生物活性
• 4.4.1 化合物DZ-3
• 4.4.2 化合物DZ-6
• 4.4.3 化合物DZ-7
• 4.4.4 化合物DZ-9
• 4.4.5 化合物DZ-17
• 4.4.6 化合物DZ-20
• 4.4.7 化合物DZ-22
• 4.4.8 化合物DZ-23
• 4.4.9 化合物DZ-24
• 4.5 结论与展望
• 4.5.1 结论
• 4.5.2 展望
• 参考文献
• 致谢