硒对饮水型氟中毒致脑损伤的干预分子机理研究

论文摘要

氟（fluorine, F）是电负性最强的非金属元素,广泛分布于自然界,人可通过各种来源如水、土壤、空气接触到氟化物。过量氟摄入在体内长期蓄积会引起慢性氟中毒,可引起氟骨症、氟斑牙等骨相器官的损害以及血液、神经系统等非骨相器官的损害。神经组织对氟的敏感性很高,海马作为中枢神经系统中氟中毒的靶部位之一其神经细胞易受氟的影响而发生可塑性变化。探求治疗氟中毒的药物已是紧迫的课题。流行病学现场调查和动物实验均已表明,一定剂量的硒可缓解氟中毒,使尿氟排泄,纠正氧自由基和脂代谢混乱,明显抑制氟诱导的脂质过氧化,改善氟中毒所致大脑损伤的作用。迄今为止,关于硒对氟中毒致机体骨相系统损伤的拮抗研究已有一定进展,对中枢神经系统的研究虽然也有报道,但缺乏深入性和系统性。此外,为了寻求既有最佳抗氟效果又不产生毒副作用的硒剂量,有必要在前期亚慢性研究所得1.5 mg/L剂量的基础上,寻求更小更安全的硒抗氟剂量。研究方法：实验分为拮抗组、预防组、治疗组：（1）拮抗组：240只Sague-Dwley（SD）大鼠,随机分8组,每组30只。对照组饮用自来水,染氟组饮用50 mg/L的氟化钠溶液,3个染硒组分别饮用0.375 mg/L、0.75 mg/L、1.5mg/L的亚硒酸钠溶液,3个氟+硒组分别饮用50 mg/L的氟化钠和上述3种浓度亚硒酸钠两两组合的溶液,染毒时间为6个月；（2）预防组：120只SD大鼠,随机分为4组,每组30只。先水后氟对照组先饮用自来水后饮用50 mg/L氟化钠溶液,3个先硒后氟组分别先饮用3种不同浓度亚硒酸钠溶液后,再饮用50 mg/L氟化钠溶液,时间各为6个月；（3）治疗组：120只SD大鼠,随机分为4组,每组30只。先氟后水对照组先饮用50 mg/L氟化钠溶液后饮用自来水,3个先氟后硒组大鼠饮用50 mg/L氟化钠溶液后,再饮用3种不同浓度的亚硒酸钠溶液,时间各为6个月。每组实验均以大鼠的行为、学习记忆、海马突触体细胞内钙离子浓度、NF-κB蛋白表达水平为观测点,全面评价比较硒预防、拮抗和治疗饮水型慢性氟中毒所致学习记忆损伤作用效果和硒的最佳抗氟剂量,观察其在不同剂量硒对饮水型氟中毒所致学习记忆损伤干预过程中表达变化的趋势,探求硒拮抗氟中毒的作用靶点,进一步探索硒对饮水型氟中毒致学习记忆损伤的干预分子机理,为抗氟剂的研制和应用提供科学依据。实验结果：1、开场行为：与对照组先水后氟组相比,先低硒后氟和先中硒后氟组大鼠在新异环境中3分钟跑动格数显著上升（P<0.05）。染氟组大鼠较对照组相比,扶壁和理毛次数显著增加（P<0.05）,而中硒组较染氟组显著下降（P<0.05）,站立次数中硒和高硒+氟组较对照组显著上升（P<0.05）。以上结果表明,虽然各组大鼠在开场行为中个别指标有显著差异,但综合考虑其它指标可以看出大鼠个体差异较大。2、过量氟摄入会导致大鼠学习记忆的下降,与对照组相比,在训练第三天和第四天,染氟组大鼠逃避潜伏期显著延长（p<0.05）,第五天穿越平台数也显著减少（p<0.05）。在训练第四天,先低硒后氟较对照组先水后氟组的逃避潜伏期显著下降（p<0.05）；第五天穿越平台数,先低硒后氟组与对照组先水后氟组相比显著增加（p<0.05）；在训练第三天,先氟后中硒组较对照组先氟后水组相比逃避潜伏期显著缩短（p<0.05）,第五天穿越平台数,先氟后中硒组与对照组先氟后水组相比显著增加（p<0.05）,说明低硒（0.375 mg/L）对氟中毒所致学习记忆的损伤有较好的预防,而中硒（0.75 mg/L）有较好的治疗作用。3、HE染色结果显示,慢性氟中毒可损伤大鼠神经细胞形态结构。与对照组相比,染氟组大鼠海马神经细胞分布稀疏,细胞轮廓消失,并出现空泡。低硒、高硒加氟组、先低硒后氟组和先氟后中硒组大鼠脑海马CA3区细胞排列紧密有序,说明适当浓度的硒可减轻氟中毒,对海马细胞起到保护作用。4、突触体Ca2+浓度检测结果显示,染氟组与对照组相比,突触体Ca2+浓度显著升高（p<0.05）：而低硒能很好的预防由氟中毒引起的Ca2+的超载。与对照组先水后氟组相比,先低硒后氟组大鼠脑海马内Ca2+浓度显著降低（p<0.05）。治疗组各组突触体Ca2+浓度未有显著差异。5、IHC结果显示,染氟组和高硒组大鼠脑海马内NF-κB表达量显著高于对照组（p<0.05）,高硒加氟组大鼠脑海马内NF-κB表达量与染氟组相比明显减少（p<0.05）。先低硒后氟组大鼠脑海马内NF-κB表达量显著低于对照组水到氟组（p<0.05）。但先氟后低硒组大鼠脑海马内NF-κB表达量显著高于对照组先氟后水组（p<0.05）。提示单独饮用高硒会损害大脑,增加NF-κB表达量,而高硒与氟却表现出拮抗作用。低硒有明显的预防氟中毒作用,但染氟后饮用低硒溶液却没有显著效果。综合所述,慢性氟暴露对大鼠中枢神经系统有毒性作用,可导致海马神经细胞分布稀疏,细胞的轮廓消失,并出现空泡,引起海马突触体Ca2+超载,继而导致钙离子信号通路中NF-κB p65蛋白表达异常,导致大鼠学习记忆能力的下降；而低硒（0.375 mg/L）对氟中毒所致学习记忆的损伤有较好的预防作用；中硒（0.75 mg/L）则有显著的治疗效果；而高硒（1.5 mg/L）具有拮抗作用。NF-κB可能是硒拮抗氟中毒的药物靶点之一,这为进一步深入探讨硒拮抗氟中毒对中枢神经系统毒性作用的分子生物学机制提供了一定的研究资料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 1. 绪论
• （一） 氟
• 1.1 地方性氟中毒研究概况
• 1.2 氟的生物学效应
• 1.3 氟毒性的研究进展
• 1.3.1 氟中毒对骨相组织的影响
• 1.3.2 氟中毒对血液的影响
• 1.3.3 氟中毒对神经系统的影响
• 1.3.4 氟中毒对肾脏、肝脏、生殖系统的影响
• 1.4 氟中毒发病机制的研究进展
• 1.4.1 氟损伤自由基代谢和抗氧化系统功能的理论
• 1.4.2. 氟中毒基因的表达和细胞信息的传导
• 1.4.3 氟诱导细胞凋亡理论
• 1.4.4 氟在体内与某些分子或基团形成氢键理论
• （二） 硒
• 2.1 硒在自然界中的分布及存在形态
• 2.2 硒拮抗氟中毒的机制
• 2.3 硒拮抗氟中毒的研究进展
• 2.4 其他元素拮抗氟中毒的研究进展
• （三） 小结
• 2. 材料和方法
• 2.1 实验动物
• 2.2 模型制作方法
• 2.2.3 主要器材和试剂
• 2.2.3.1 器材
• 2.2.3.2 试剂
• 2.3 大鼠行为及学习记忆能力的检测方法
• 2.3.1 空间分辨及学习记忆能力的检测
• 2+浓度的测定'>2.4 海马突触体内Ca²⁺浓度的测定
• 2.4.1 实验原理
• 2.4.2 突触体膜的制备
• 2.4.3 荧光探针负载
• 2.4.4 荧光值测定
• 2.5 脑海马CA3区内NF-κB表达水平的测定
• 2.5.1 HE染色
• 2.5.2 免疫组织化学染色
• 2.6 图像分析
• 2.7 统计学处理
• 3. 结果
• 3.1 硒对氟中毒的拮抗作用
• 3.1.1 硒氟拮抗作用对大鼠空间学习与记忆的影响
• 3.1.2 硒氟拮抗作用对大鼠海马内钙离子浓度的影响
• 3.1.3 硒氟拮抗作用对大鼠海马CA3区HE染色的影响
• 3.1.4 硒氟拮抗作用对大鼠NF-κB ρ65表达与免疫组化的影响
• 3.2 硒对氟中毒的预防作用
• 3.2.1 硒对氟中毒大鼠空间学习与记忆损伤的预防作用
• 3.2.2 硒对氟中毒大鼠海马内钙离子浓度的影响
• 3.2.3 硒对氟中毒大鼠海马CA3区HE染色的影响
• 3.2.4 硒对氟中毒大鼠NF-κB ρ65表达与免疫组化的影响
• 3.3 硒对氟中毒的治疗作用
• 3.3.1 硒对氟中毒大鼠空间学习与记忆损伤的治疗作用
• 3.3.2 硒对氟中毒大鼠海马内钙离子浓度的治疗作用
• 3.3.3 硒对氟中毒大鼠海马CA3区HE染色的治疗作用
• 3.3.4 硒对氟中毒大鼠NF-κB ρ65表达与免疫组化治疗作用
• 4. 讨论
• 4.1 硒氟拮抗作用对大鼠空间学习记忆的影响及其机制探讨
• 4.2 硒对氟中毒大鼠空间学习与记忆损伤的预防作用及其机制探讨
• 4.3 硒对氟中毒大鼠空间学习与记忆损伤的治疗作用及其机制探讨
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间取得的研究成果