芥菜型油菜种皮颜色相关基因克隆、表达分析及RNAi载体构建

论文摘要

大量研究表明,在相同的遗传背景下,黄籽油菜与黑籽油菜相比,黄籽油菜具有含油量高、种皮薄、色素少、纤维素含量低、油清澈透明、蛋白质含量高等优点,培育高产优质的黄籽油菜成为重要的育种目标。研究表明,芥菜型油菜黄籽形成涉及类黄酮合成基因。本研究通过RT-PCR技术,对12个不同地区来源的芥菜型油菜品种授粉后20天的种皮分析类黄酮合成相关基因的表达情况,结果表明:结构基因PAL、C4H、CHI、F3H、F3′H、TT10、TT12、GST和调节基因TT2、TT8、TT16、TTG1、TTG2在12个黄、黑籽材料种皮间都有表达,而C4H、TT12、LAC和TT1在不同的黄、黑籽材料中的表达有量的差异。但是DFR和ANS在12个黄、黑籽种皮中有表达差异,这2个基因在5个黑籽材料种皮中有表达,而在7个黄籽材料种皮中没有检测到表达;而BAN基因在5个黑籽材料都有较高的表达,在3个黄籽材料中有较弱的表达,而其他的黄籽材料不表达。由此表明DFR,ANS,BAN这3个基因是油菜黄黑籽差异的关键基因。选用芥菜型油菜紫叶芥为材料,通过SMARTTM-RACE技术,从BjANS的保守区出发,分别获得BjANS基因的3’和5’端序列,利用DNAMAN4.0将保守区、3’和5’端序列拼接后得到BjANS基因全长cDNA序列。通过生物信息学分析,获得一个开放阅读框,编码359个氨基酸。构建了启动子为napinA的植物干扰载体pRNAi-ANS,并通过冻融法将重组质粒成功地导入根癌农杆菌菌株EHA105中,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文章综述
• 1.1 国内外研究动态
• 1.1.1 油菜种皮颜色的形成中相关色素物质的研究
• 1.1.2 油菜种皮颜色的遗传
• 1.1.3 油菜种皮颜色相关基因的研究
• 1.2 基因克隆方法
• 1.2.1 基因克隆的方法
• 1.2.2 RACE在植物基因克隆上的技术优点
• 1.3 RNAi干涉
• 1.3.1 RNAi的作用机制
• 1.3.1.1 转录后基因沉默
• 1.3.1.2 转录水平基因沉默
• 1.3.1.3 翻译水平上基因沉默
• 1.3.2 RNAi在植物中的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 花色素合成酶基因（ANS）的全长克隆及分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 油菜种皮总RNA提取方法
• 2.1.3 cDNA合成
• 2.1.4 芥菜型油菜ACTIN基因扩增引物
• 2.1.5 芥菜型油菜类黄酮合成基因引物设计
• 2.1.6 PCR反应体系和扩增程序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 RNA提取及检测
• 2.2.2 基因表达RT-PCR分析
• 2.3 讨论
• 第三章 芥菜型油菜花色素合成酶基因（ANS）的全长克隆和序列分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 分子生物学试剂与试剂盒
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 紫叶芥种皮总RNA的提取
• 260值'>3.2.2 测定所提取RNA的OD₂₆₀值
• 3.2.3 特异引物设计
• 3.2.4 3'RACE获得3'端目的基因片段
• 3.2.4.1 从总RNA获得第一条cDNA
• 3.2.4.2 3'端目的基因片段的扩增
• 3.2.5.3'端目的基因片段的切胶回收
• 3.2.6.3'端目的基因片段克隆到pMDT-18上
• 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.8 热激法转化大肠杆菌
• 3.2.9 PCR检测及测序
• 3.2.10 5'RACE获得5'端目的基因片段
• 3.2.10.1 第一链cDNA的合成
• 3.2.10.2 5'端目的基因片段的扩增
• 3.2.11 5'端目的基因片段的PCR产物回收,连接,转化及测序
• 3.2.12 对获得目的片段进行生物信息学分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 BjANS基因序列
• 3.4 讨论
• 第四章 芥菜型油菜ANS基因RNAi载体的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.2 菌株
• 4.1.1.3 载体与质粒
• 4.1.1.4 分子生物学试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 油菜总DNA的制备
• 4.1.2.2 PCR扩增
• 4.1.2.2.1 napinA启动子的扩增
• 4.1.2.2.2 ANS基因干扰片段的扩增
• 4.1.2.3 PCR产物回收
• 4.1.2.4 PCR产物的测序和比对
• 4.1.2.5 干扰载体的构建
• 4.1.2.5.1 napinA启动子插入pFGC5941质粒
• 4.1.2.5.2 干扰片段反向插入pFGC.napin质粒
• 4.1.2.5.3 干扰片段正向插入pN-ANS质粒
• 4.1.2.6 热激法转化大肠杆菌
• 4.1.2.7 冻熔法转化根癌农杆菌
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 启动子和目的基因序列克隆与PCR扩增检测结果
• 4.2.2 测序结果比对
• 4.2.3 启动子的酶切验证
• 4.2.4 干扰载体的酶切验证
• 4.2.5 转化农杆菌质粒PCR检测
• 4.3 讨论
• 第五章 小结
• 参考文献
• 缩写词
• 致谢
• 作者简历