论文摘要
背景:内皮祖细胞（EPCs）属于造血干细胞的一个亚群,它们直接参与体内血管新生和修复。Asahara等人于1997年成功地从人类外周血中分离出表达CD34,Flk-1,或AC133抗原阳性的细胞,并被证实为EPCs。循环血中EPCs归巢到机体的相应部位并分化为内皮细胞,参与构成新生血管,这个过程称之为出生后血管发生。血管发生以往被认为只存在于胚胎期的血管新生过程中,但近来的许多研究证明:出生后同样可以存在血管发生。最近的动物实验研究证实:外源性EPCs移植对下肢和心脏缺血性病变产生一定的治疗效果,这为临床缺血性血管疾病的治疗提供了新思路。研究目的:通过研究,探索改进人外周血中EPCs分离和体外培养的方法,探明人外周血中EPCs体外培养的生长特征,找寻最佳细胞干预时期,为人外周血EPCs的研究奠定基础。同时,利用Transwell培养皿模拟体外EPCs的迁移过程,观察阿司匹林对EPCs的体外迁移功能的影响,旨在为临床缺血性血管疾病治疗中阿司匹林的合理应用提供参考。方法:本研究方法围绕着EPCs分为相互关联的两部分一、人类外周血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定:无菌条件下采集健康捐献者外周静脉血20ml,运用Ficoll密度梯度离心法,将常规的2000rpm调整至1200rpm,分离外周血中单个核细胞（MNCs）,经过细胞计数,台盼蓝染色鉴定细胞活力后,用含有10%优级胎牛血清的人类内皮祖细胞培养基按常规进行培养。对培养所得的细胞每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态学变化,观测评价细胞生长过程。并进行EPCs特征和功能的鉴定:1、VEGFR-2、CD133、vWF的免疫荧光检测;2、细胞摄取acLDL和结合UEA-1实验。二、阿司匹林对内皮祖细胞迁移功能的影响:在第一部分研究的基础上,选择培养7天的细胞进行这一步研究。将培养7天的细胞消化,重悬,计数后将悬液放入Transwell培养皿的上室。将含有不同浓度阿司匹林的含血清培养液加入到Transwell培养皿的下室,将Transwell培养皿放入细胞培养箱中培养24h后计数迁移到低层的细胞,以观察评价细胞迁移能力。通过与无阿司匹林的含血清培养液组比较,观测不同浓度作用相同时间或同一浓度作用不同时间,阿司匹林对人外周血中EPCs迁移功能的影响。结果:将离心速度调整至1200rpm后,每ml外周血经Ficoll密度梯度离心法分离可得到MNCs 1×106～2×106个,台盼蓝染色后活细胞百分率在95±3%。培养后早期细胞大多为圆形或椭圆形,混有少量纺锤形细胞,第5天起,部分圆形大单核细胞转化为梭形贴壁内皮祖细胞;7天左右出现由数十个细胞形成的细胞集落,并可见到细胞呈条索状排列;10天左右,细胞变为长梭形,相互交联;14天后细胞开始衰老、崩解,数量减少。在培养的第7天,细胞生长性状最佳,通过检测,细胞的内皮祖细胞系特异性标志因子VEGFR-2、CD133与vWF表达良好,摄取acLDL和结合UEA-1实验均呈强阳性。选取培养第7天的细胞,采用Transwell培养皿检测阿司匹林对EPCs迁移能力的影响,在200倍显微镜下计数Transwell膜底面的迁移细胞。无阿司匹林对照组26.8±1.73,加入1mmol/L阿司匹林组24.3±1.94,加入2mmol/L阿司匹林组20.1±2.57,加入5mmol/L阿司匹林组13.1±1.87,加入10mmol/L阿司匹林组9.2±1.58。经统计分析证实,加入阿司匹林组Transwell膜底面细胞数较对照组显著减少,随着加入阿司匹林的浓度增加,Transwell膜底面细胞数的减少幅度更为明显。结论:1、在25～37℃条件下,采用离心速度为1200rpm的密度梯度离心法可以良好的分离人外周血单个核细胞,以满足EPCs培养的需要。2、内皮祖细胞的表型鉴定和活性测定显示其旺盛生长期在培养后的第7—10天,在此期间,其增殖活跃,生长情况较好,是进一步进行研究的最佳时期。3、在Transwell培养过程中,1mmol/L的阿司匹林就能对EPCs的体外迁移产生抑制作用,这种抑制作用具有明显的浓度和时间依赖性。
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