甲基对硫磷降解菌Sphingopyxis sp.DLP-2的生物学特性及Tnmpd的克隆和功能鉴定

论文摘要

有机磷农药是一类应用范围广泛、高效广谱的杀虫剂,为农业增产增收带来保障的同时,也带来了一系列环境问题。污染环境的微生物修复因具有无二次污染等优点而得到广泛的关注。本文从分离甲基对硫磷降解菌着手,进而研究其生物学特性、降解特性、基因和基因簇的克隆分析及水平转移现象的验证,旨在为有机磷农药的微生物降解提供理论依据。采用富集培养法从农药厂废水处理池的活性污泥中分离到一株甲基对硫磷降解菌DLP-2。经形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列相似性比较,初步将其鉴定为Sphingopyxis sp. （GenBank Accession NO. JF833116）。菌株DLP-2最适生长条件为：pH 7.0,温度30℃。菌株DLP-2降解甲基对硫磷的最适条件为：pH 7.0,温度30℃。与菌株的最适生长条件相一致。该菌在12 h内对50 mg·L-1MP的降解率达99%以上。但当其浓度达到100 mg·L-1时,仅可将MP降解为对硝基苯酚（PNP）可能由于累积的PNP对其有毒害作用所致。DLP-2对MP的降解与接种量呈正相关。DLP-2菌株对乙基对硫磷和辛硫磷降解效果达80%以上,对毒死蜱和杀螟硫磷降解效果为50%以上,对杀扑磷、甲基异柳磷和三唑磷降解能力较弱,其降解率低于20%。通过PCR的方法,从菌株DLP-2中克隆出完整的甲基对硫磷水解酶基因mpd,在线比对序列相似性表明其与已报道的mpd和mph基因同源性达到99%。将其基因构建到表达载体pET29a,并在E.coli BL21（DE3）中进行表达,得到了分子量符合预期大小的表达产物（35 KDa）。通过PCR的方法,从菌株DLP-2中扩增出包含mpd基因在内的基因簇Tnmpd,大小为4552 bp。通过在线进行序列比对分析,其与已报道的Tnmph基因序列相似性为99%（GenBank accession No.EF463103）。该基因簇包括mpd基因及其上下游各一个典型的移动元件IS6100,据此推测mpd基因可能具有在菌株之间进行水平转移的能力。为了验证mpd基因是否具有水平转移的能力,我们将Tnmpd连接到自杀性质粒pJQ200SK上,通过三亲结合,Tnmpd成功转移到受体菌Pseudomonas putida KT2440的染色体上,并使其具有了降解甲基对硫磷的能力。该结果对Tnmpd的水平转移能力进行了验证。并为其在基因强化生物修复有机磷污染环境中的应用提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 有机磷农药概述
• 1. 有机磷农药的化学结构及危害机理
• 2. 甲基对硫磷的性质及危害
• 3. 有机磷农药在环境中的降解方式
• 第二节 微生物降解有机磷农药的研究进展
• 1. 降解有机磷农药的微生物
• 2. 甲基对硫磷的代谢机理及途径
• 3. 甲基对硫磷水解酶MPH的结构与功能研究
• 4. 有机磷水解酶基因
• 5. 有机磷水解酶基因的水平转移
• 6. 微生物降解有机磷农药展望
• 第二章 甲基对硫磷降解菌的分离及生物学特性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试菌株、试剂及培养基
• 1.2 甲基对硫磷降解菌的分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 16S rRNA基因序列的扩增及测序
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定
• 1.6 菌体生长量的测定
• 2. 结果与讨论
• 2.1 甲基对硫磷降解菌的分离
• 2.2 降解菌株的菌落形态、生理生化特征
• 2.3 菌株DLP-2的16S rRNA基因序列扩增
• 2.4 菌株DLP-2的鉴定结果
• 2.5 环境条件对降解菌株DLP-2生长的影响
• 3. 小结
• 第三章 甲基对硫磷降解菌株DLP-2的降解特性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 供试菌株
• 1.3 菌体生长量的测定
• 1.4 有机磷农药及PNP的含量检测方法
• 1.5 种子液培养
• 2. 结果与讨论
• 2.1 甲基对硫磷降解、对硝基酚生成和菌株DLP-2生长的关系
• 2.2 甲基对硫磷起始浓度对菌株DLP-2降解甲基对硫磷的影响
• 2.3 pH值对菌株DLP-2降解甲基对硫磷的影响
• 2.4 温度对菌株DLP-2降解甲基对硫磷的影响
• 2.5 接种量对菌株DLP-2降解甲基对硫磷的影响
• 2.6 菌株DLP-2对其他几种有机磷农药的降解
• 3. 小结
• 第四章 有机磷水解酶基因（mpd）的克隆及表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 菌体基因组DNA的提取
• 1.4 质粒DNA的小量提取
• 1.5 普通感受态细胞的制备
• 1.6 有机磷水解酶基因的引物设计和PCR扩增
• 2. 结果与讨论
• 2.1 PCR法克隆甲基对硫磷水解酶基因
• 2.2 序列测定与比较分析
• 2.3 mpd基因在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 3. 小结
• 第五章 基因簇Tnmpd的扩增、分析及功能验证
• 1. 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 菌株基因组DNA和质粒的提取
• 1.4 有机磷农药及PNP的含量检测方法
• 1.5 基因簇的PCR扩增
• 1.6 PCR产物的TA克隆
• 1.7 基因序列的测定与序列分析
• 1.8 PCR产物的纯化及酶切
• 1.9 载体的制备
• 1.10 酶连及酶连产物的转化
• 1.11 三亲结合
• 1.12 受体菌降解性能的检测
• 2. 结果与讨论
• 2.1 Tnmpd基因簇的扩增和分析
• 2.2 序列测定与比较分析
• 2.3 重组质粒pJQ-Tnmpd的构建与转化
• 2.4 菌株KT2440/Tnmpd中mpd和Tnmpd基因的扩增
• 2.5 菌株KT2440/Tnmpd对甲基对硫磷的降解
• 3. 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方
• 附录二 相关DNA序列
• 附录三 攻读硕士学位期间发表或已接受的论文
• 致谢