ε-聚赖氨酸高产菌株选育与发酵过程优化

论文摘要

本论文主要内容是,首先鉴定本实验室自行筛选的一株白色链霉菌Z–18是否具有合成ε–聚赖氨酸的能力;在此基础之上,建立了一种用于菌种改造中高产菌株筛选的方法;最后,对白色链霉菌Z–18发酵生产ε–聚赖氨酸的发酵工艺进行了初步研究。为了确定本实验室筛选的白色链霉菌Z–18具有合成ε–聚赖氨酸的能力,本论文利用高效液相色谱（HPLC）、液相–质谱联用（LC–MS）、核磁共振（NMR）、高效液相排阻色谱（GPC）等分析仪器对白色链霉菌Z–18发酵生产的ε–聚赖氨酸产物进行了结构表征的研究。研究发现:白色链霉菌发酵生产的聚赖氨酸是由赖氨酸单体通过ε–NH2和α–COOH形成ε–酰氨键聚合而成,平均分子量为4210 Da,并且对敏感菌——枯草芽孢杆菌生长有强烈的抑制作用。菌种改造对于提高菌株个体合成产物的能力是一种十分有效的方法。由于白色链霉菌的代谢途径还不清楚,所以现阶段选择传统诱变是提高其合成ε–聚赖氨酸能力的有效途径。本论文利用亚硝基胍（NTG）对白色链霉菌孢子进行诱变,用ε–PL + Gly作为抗性平板,用于高产菌株的筛选。通过建立这种新型诱变筛选方法,获得了一株产量为1.05 g/L,遗传稳定的突变株Streptomyces albulus A–1,该突变株较出发菌株产量提高了54%。最后,本论文通过对发酵过程中溶解氧、转速、通风量和pH值等参数的单因素考察,确定了pH值是影响白色链霉菌Z–18合成ε–聚赖氨酸的关键性因素。研究发现,白色链霉菌Z–18在pH4.0以上有利于菌体的生长,但对产物的积累不利（0.8 g/L左右）;而当pH维持在4.0左右时,不仅有利于菌体的生长,而且对产物的积累也起到积极的作用（1.6 g/L以上）。随后,在控制pH4.0的情况下,采用补料分批培养方式,使得发酵时间延长至98h,并且使得菌体干重达到20 g/L左右,与此同时,ε–聚赖氨酸产量也有了大幅度的提高,最高产量达到8.02 g/L,比摇瓶产量提高近10倍,比分批发酵提高了近5倍。可见,在白色链霉菌合成ε–聚赖氨酸的发酵过程中,控制pH4.0,再流加碳源和氮源可以使得ε–聚赖氨酸获得大量的积累。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 食品防腐剂背景
• 1.2 化学合成类防腐剂
• 1.2.1 苯甲酸及其钠盐
• 1.2.2 山梨酸及其钾盐
• 1.2.3 对羟基苯甲酸酯类（甲、乙、丙、异丙、丁、异丁、庚等酯）
• 1.2.4 硝酸盐及亚硝酸盐
• 1.3 天然型防腐剂
• 1.3.1 植物源天然防腐剂
• 1.3.2 动物源天然防腐剂
• 1.3.3 微生物来源天然防腐剂
• 1.4 本论文研究目的和意义
• 1.4.1 研究的意义
• 1.4.2 研究的目的和内容
• 第二章 ε–聚赖氨酸结构鉴定及抑菌活性的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 微生物菌种
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.6 样品生物活性检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产物的纯度测定
• 2.3.2 样品结构信息
• 2.4 本章小结
• 第三章 ε–聚赖氨酸高产菌株的选育
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂与材料
• 3.2.2 仪器与设备
• 3.2.3 相关溶液的配制
• 3.2.4 微生物菌种
• 3.2.5 培养基
• 3.2.6 分析方法
• 3.2.7 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 ε–聚赖氨酸和甘氨酸抗性平板浓度的确定
• 3.3.2 NTG 诱变筛选抗 ε–PL+Gly 高产菌株
• 3.3.3 高产突变株传代稳定性
• 3.4 本章小结
• 第四章 ε–聚赖氨酸产生菌发酵工艺初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂与材料
• 4.2.2 仪器与设备
• 4.2.3 微生物菌种
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.5 分析方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 溶解氧对白色链霉菌合成 ε–聚赖氨酸的影响
• 4.3.2 通风量对白色链霉菌合成 ε–聚赖氨酸的影响
• 4.3.3 pH 对白色链霉菌合成 ε–聚赖氨酸的影响
• 4.3.4 白色链霉菌补料分批培养
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 论文发表和撰写一览表