稻瘟病菌菌株FJ81278无毒基因Avr-Pid2的定位及深度测序分析

论文摘要

稻瘟病是世界水稻生产上的重要病害之一,严重影响各国的粮食安全。培育抗病品种是防治该病最为经济有效的措施,但往往由于稻瘟病菌无毒基因发生变化的菌株在群体中占优势,导致病菌群体能够使相对应的抗性基因在田间丧失作用。稻瘟病菌与水稻的互作符合基因对基因关系,因此,对稻瘟病菌无毒基因的研究不仅有助于揭示稻瘟病菌的致病机理,而且有助于阐明水稻和稻瘟病菌的互作和进化机制,为水稻抗病品种布局与利用提供重要信息。为克隆Avr-Pid2,用菌株GUY11和FJ81278及其有性后代群体对水稻品种Pi-d2及其亲本TP309进行毒性分析,结果表明:菌株FJ81278对Pi-d2无毒,推测含Avr-Pid2;GUY11和FJ81278的有性后代在Pi-d2上的无毒、有毒分离比例符合1:1,推断FJ81278对Pi-d2的无毒性由单一基因座控制。通过SSR标记和转座子元件标记分析,获得了与无毒基因Avr-Pid2连锁的标记Propiz-t和ms7-27/28,它们与Avr-Pid2的遗传距离分别为6.1 cM、13.0 cM。这些标记的获得将Avr-Pid2限制在染色体上大约420kb的物理距离范围内,为下一步的精细定位及克隆奠定了良好基础。进一步采用深度测序对菌株FJ81278进行基因组和转录组分析。结果显示,菌株FJ81278基因组中预测基因10483个,通过和GUY11基因组比较,获得FJ81278中特异的基因678个,其中编码含有信号肽蛋白的基因161个。转录组测序分析结果表明,与稻瘟病菌70-15数据库比对,得到9759条已有注释的转录本,未注释的新转录本3706条,占总数的37.9%;基因结构优化有5端延长和3端延长;发现可变剪切基因1464个,占基因总数的13.0%左右,内含子保留是主要的可变剪接模式;此外还分析出2470个单核苷酸多态（SNP）位点、1007个插入或缺失多态性（InDel）位点。以AgriGO分析有表达的转录本结果显示,分子功能、生物学过程和细胞组分3大类被划分为更详细的31个小的类别,分类结果显示了稻瘟病菌发育各阶段基因表达谱的总体情况。分析转录丰度较低的基因结果显示,转录丰度较低的基因多是与互作、应激反应有关的基因。通过高通量测序技术发现了菌株FJ81278批量特异基因及其表达情况,为我们研究稻瘟病菌基因表达的组织特异性和表达水平、致病机制、物种进化和互作机制提供了科学依据。已克隆的稻瘟病菌无毒基因多为小的、无同源性的分泌蛋白,因此我们初步把21个编码蛋白含信号肽（<300aa）的特异基因作为菌株FJ81278中无毒基因的候选基因,通过酵母同源重组进行过表达分析,并在福建田间菌株中做关联分析。结果表明,大部分的过表达转化子对含有抗性基因的水稻的致病性与野生型菌株相同,未发生毒性变化;对致病性发生变化的需通过实验进一步验证;所研究的特异基因在田间菌株中的扩增结果表明,分子扩增的多态性与表型无明显相关,需要用更多的亲缘关系较远的田间菌株对更多的特异基因做关联分析。21个预测含有信号肽的特异基因多无保守结构域,而MoUng5编码的蛋白MoHsbA预测含有疏水表面结合蛋白A（HsbA）结构域,对其进行生物信息学分析和表达分析,结果表明,该假定编码的蛋白含有信号肽剪切位点,是疏水性蛋白。通过qRT-PCR分析该基因在菌丝、孢子、附着胞阶段的表达,结果表明该基因在各阶段都有表达,但表达量不同,在附着胞阶段相对表达水平较高,约是菌丝阶段表达量的1.3倍,在孢子阶段相对表达量较低。推测MoHsbA可能与稻瘟病菌附着胞的发育过程密切相关。研究结果为进一步揭示HsbA基因在稻瘟病菌长发育、致病中的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 稻瘟病菌的侵染过程
• 2 稻瘟病菌无毒基因研究进展
• 2.1 稻瘟病菌无毒基因的克隆方法
• 2.2 稻瘟病菌无毒基因的结构与功能
• 2.3 稻瘟病菌无毒基因在田间菌株群体中的遗传多样性和变异
• 2.4 稻瘟病菌无毒基因的分子标记与定位
• 3 基因组深度测序及其在功能基因组学研究中的应用
• 3.1 基因组测序技术的发展
• 3.2 深度测序在功能基因组学研究中的应用
• 3.2.1 DNA 测序
• 3.2.2 RNA 测序
• 4 基因功能的研究方法
• 4.1 基因的生物信息学分析
• 4.2 基因功能的实验学验证
• 4.2.1 基因敲除
• 4.2.2 基因的过表达
• 4.2.3 反向遗传学
• 4.2.4 基因的时空表达分析
• 4.2.5 cDNA 微阵列分析
• 5 本研究的意义
• 第二章 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pid2 的初步定位
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试水稻
• 1.1.3 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 稻瘟病菌亲本菌株GUY11、FJ81278 及有性杂交后代的毒性分析
• 1.2.2 SSR 分子标记的筛选
• 1.2.3 PATE 标记
• 1.2.4 遗传图谱的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株GUY11、FJ81278 在抗性水稻上的致病性分析
• 2.2 菌株GUY11 和FJ81278 的有性后代在Pi-d2 上的毒性分析
• 2.3 与Avr-Pid2 基因连锁的分子标记的筛选
• 2.4 遗传图谱的构建
• 3 小结与讨论
• 第三章 稻瘟病菌菌株FJ81278 的深度测序分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌丝、孢子、附着胞的准备
• 1.2.2 RNA 的提取
• 1.2.3 RNA 甲醛变性胶电泳
• 1.2.4 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA 的定量定性分析
• 2.2 FJ81278 基因组分析
• 2.3 FJ81278转录组分析
• 2.3.1 测序结果评估
• 2.3.2 测序数据分析
• 3 小结与讨论
• 第四章 稻瘟病菌菌株FJ81278 中特异基因的功能互补和关联分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试水稻
• 1.1.3 供试质粒
• 1.1.4 培养基与试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 稻瘟病菌基因组DNA 的提取
• 1.2.2 酵母同源重组过表达载体构建
• 1.2.3 酵母同源重组
• 1.2.4 稻瘟病菌的遗传转化
• 1.2.5 过表达转化子的表达分析
• 1.2.6 过表达转化子的表型分析
• 1.3 特异基因的关联分析
• 1.3.1 田间菌株在Pi-d2 上的毒性分析
• 1.3.2 特异基因在田间菌株中的关联分析
• 2 结果与分析
• 2.1 特异基因的生物信息学分析
• 2.2 特异基因的功能互补
• 2.2.1 特异基因ORF 的扩增
• 2.2.2 pDL1 Vector 的酶切
• 2.2.3 酵母同源重组转化子质粒验证
• 2.2.4 大肠杆菌超感质粒PCR 验证
• 2.2.5 过量表达转化子的验证
• 2.2.6 过量表达转化子的表型分析
• 2.3 特异基因关联分析
• 2.3.1 田间菌株在Pi-d2 上的致病性分析
• 2.3.2 特异基因在田间菌株中的关联分析
• 2.3.3 特异基因在部分有性后代中的分析
• 3 小结与讨论
• 第五章 FJ81278 中一个假定疏水表面结合蛋白基因的功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 实验数据
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 生物信息学分析
• 1.2.2 提取菌丝、孢子、附着胞RNA
• 1.2.3 cDNA 扩增
• 1.2.4 qRT-PCR
• 1.2.5 相对定量表达分析
• 2 结果与分析
• 2.1 生物信息学分析
• 2.1.1 MoHsbA 结构与特性分析
• 2.1.2 稻瘟病菌中含HsbA 功能域的基因结构及其特性
• 2.1.3 稻瘟病菌中含HsbA 功能域的基因功能与表达分析
• 2.1.4 HsbA 家族的系统发育关系
• 2.2 MoHsbA 在不同发育阶段的相对表达
• 2.2.1 qRT-PCR 的体系优化
• 2.2.2 相对定量表达分析
• 3 小结与讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录 1: 预测的特异基因的扩增引物及退火温度
• 附录 2: 过表达转化子接种结果
• 附录 3: 特异基因在20 个有性后代菌株中的扩增
• 致谢