机械拉伸诱导人骨髓间充质干细胞向肌腱细胞定向分化及其力信号转导的实验研究

论文摘要

机体组织/细胞处于复杂的力学微环境中,且其生长发育受到力学微环境的调控。肌腱/韧带组织是一种典型的传递肌肉收缩所产生的应力的连接性组织。它们在发育进程中,长期受到周期性牵拉产生的张应力,这对它们的形成具有重要的调节作用。然而,肌腱/韧带由于过度负载或者老化引起的损伤在日常生活中很常见,而且其预防和治疗仍是临床医生面临的挑战问题之一。骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,由于其具有来源丰富、取材简单、快速增殖、易于转染外源基因、以及低免疫抗原反应等优点,成为组织工程、基因治疗以及细胞治疗的研究热点。目前已经有研究报道机械刺激可以诱导BM-MSCs向肌腱细胞方向分化。这为利用组织工程实现肌腱/韧带损伤修复带来了新希望,但是其力信号转导和分子机理还不清楚,并成为后续研究工作的重点。为了进一步研究机械刺激对BM-MSCs向肌腱细胞方向分化的影响以及分化过程中的相关力信号转导。本文以人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs）为研究对象,利用拉伸装置（ST-140）对hMSCs加载一定的机械拉伸,通过实时定量PCR检测肌腱相关标记基因的表达情况,筛选诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化的机械拉伸条件;并且利用Y-27632、细胞松弛素D和PF 530228 （PF 228）分别抑制RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK（Focal adhesion kinase, FAK）,考察RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK在机械拉伸诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化过程中的作用。本文得到的主要实验结果如下:①hMSCs多向分化潜能多向分化潜能通常是指在体外诱导条件下具有分化为成骨细胞、成脂肪细胞和软骨细胞的能力。我们利用成骨诱导分化培养基、成脂肪诱导分化培养基和成软骨诱导分化培养基诱导hMSCs,以MSCs基础培养基培养作为对照。诱导21天后分别进行茜素红、油红O和阿尔新蓝组织化学染色。染色结果显示成骨诱导分化培养基诱导21天后,诱导组茜素红染色呈阳性而对照组呈阴性;成脂肪诱导分化培养基诱导21天后,诱导组油红O染色呈阳性而对照组呈阴性;成软骨诱导分化培养基诱导21天后,诱导组阿尔新蓝染色呈阳性而对照组呈阴性。这表明:我们的研究对象hMSCs,在体外具有分化为成骨细胞、成脂肪细胞和软骨细胞的多向分化能力。②机械拉伸诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化对hMSCs加载不同条件的机械拉伸（频率:0.1 Hz、1.0 Hz,应变大小:5%、10%、15% strain,拉伸时间:24 h、48 h）,通过实时定量RT-PCR和Western blot技术分别检测肌腱相关标记基因如Collagen type I （Col I）、Collagen type III（Col III）、tenascin-C（TNC）和scleraxis（SCX）,和肌腱相关标记蛋白如Col I和TNC的表达。实验结果显示:不同的机械拉伸引起的基因和蛋白的表达变化不尽相同。在本研究范围内,1.0 Hz、10% strain,持续时间分别为24 h和48 h能够促进肌腱相关标记基因和蛋白的表达。加载机械拉伸24 h后,Col I、Col III、TNC和SCX的基因表达分别为相应对照组的1.220±0.057倍、1.31±0.087倍、1.355±0.133倍和1.605±0.244倍;Col I和TNC的蛋白表达分别为1.191±0.042倍和1.47±0.047倍。加载机械拉伸48 h后,Col I、Col III、TNC和SCX的基因表达分别为1.285±0.049倍、1.375±0.152倍、1.64±0.146倍和2.503±0.285倍;Col I和TNC的蛋白表达分别为1.258±0.093倍和2.231±0.278倍。这些实验结果表明1.0 Hz、10% strain,持续时间48 h的机械拉伸能够诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化。同时我们观察到机械拉伸诱导hMSCs垂直于拉伸方向排列,而且细胞排列的趋势和拉伸频率、拉伸形变和拉伸时间相关。③Y-27632、细胞松弛素D和PF 228对机械拉伸诱导的actin超微结构的变化的影响以Fluoresceinisothiocyanate （FITC）-phalloidin标记细胞骨架F-actin,通过激光共聚焦显微镜观察actin的超微结构。利用Y-27632、细胞松弛素D和PF 228分别抑制RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK,考察RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK对机械拉伸诱导的hMSCs形态和actin超微结构的变化的影响。激光共聚焦显微镜的实验结果显示:静态培养的细胞随机排列,actin沿着细胞长轴呈随机排列;机械拉伸促进actin的聚合,使actin的密度升高,并诱导actin纤维垂直于拉伸方向排列。Y-27632处理的细胞,actin的聚合受到抑制,只有少数actin分布在细胞边缘;Y-27632处理的细胞加载机械拉伸后,actin呈随机排列,密度没有显著变化,但是actin变得不连续并呈点状,细胞边缘出现很短的actin。细胞松弛素D处理的细胞,actin变短且不连续,并在细胞边缘聚积;细胞松弛素D处理的细胞加载机械拉伸后,actin的不连续和点状程度更加明显,且actin呈随机排列。PF 228处理的细胞,actin并无显著变化;PF 228处理的细胞加载机械拉伸后,actin出现撕裂状,部分actin不再沿着细胞长轴排列,而是垂直于拉伸方向排列,而且拉伸后产生一些细胞碎片。这些结果表明RhoA/ROCK和FAK对机械拉伸诱导的actin的变化至关重要,而且机械拉伸通过诱导actin垂直于拉伸方向排列,最终引起细胞垂直于拉伸方向排列。④Y-27632、细胞松弛素D和PF 228抑制机械拉伸诱导的FAK 397位点Tyr磷酸化及向肌腱细胞方向分化Y-27632、细胞松弛素D和PF 228抑制机械拉伸诱导的hMSCs FAK磷酸化。Western blot结果显示Y-27632和细胞松弛素D抑制后,FAK磷酸化下降到对照组水平; PF 228处理抑制机械拉伸诱导的FAK磷酸化,将FAK磷酸化水平下降到20%左右,且磷酸化程度比对照水平更低。这表明RhoA/ROCK和细胞骨架对机械拉伸诱导的FAK磷酸化具有重要的调节作用,而PF 228作为FAK的选择性抑制剂对FAK磷酸化的抑制程度更剧烈。不仅如此,实验结果进一步显示:Y-27632、细胞松弛素D或PF 228处理,显著抑制机械拉伸诱导的肌腱相关标记基因（Col I、Col III、TNC、SCX、EphA4、Eya2和Six1）和蛋白（Col I、Col III和TNC）的表达。相比而言,PF 228的抑制效果更加剧烈。这表明RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK调节机械拉伸诱导的hMSCs向肌腱细胞方向分化。在这个分化过程中,RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK之间相互影响、相互调节,组成一个力学感应的信号网络。这个信号网络感应胞外力学环境,并将力信号转变为生化信号,并进一步触发向肌腱细胞方向分化进程。抑制这个信号网络中的任何一个成员,将导致机械拉伸诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化的失败。综合以上研究表明:hMSCs不仅具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力,而且在机械拉伸加载条件（1.0 Hz,10% strain）的条件下,能够向肌腱细胞方向分化。在机械拉伸诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化过程中,激活的RhoA/ROCK、完整的细胞骨架和FAK Tyr397位点磷酸化是必要条件,而且RhoA/ROCK、细胞骨架和FAK相互影响并协同调节械拉伸诱导hMSCs向肌腱细胞方向分化。本研究对认识机械拉伸诱导hMSCs定向分化的分子基础以及分化过程中力信号传导具有重要意义,还可为临床上腱/韧带创伤的治疗及其组织工程化提供定量的参考依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 组织工程化肌腱/韧带与临床修复
• 1.2.2 骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特点
• 1.2.3 MSCs 多向分化能力
• 1.2.4 力信号传导
• 1.3 本文研究的目的、意义以及主要内容
• 1.3.1 本文研究目的及意义
• 1.3.2 本文研究的主要内容
• 2 人骨髓间充质干细胞（hMSCs）和机械拉伸装置
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 细胞来源
• 2.2.2 主要仪器、耗材
• 2.2.3 主要实验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 免疫荧光染色
• 2.3.3 hMSCs 多向分化潜能特性分析
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 hMSCs 形态观察及免疫荧光染色
• 2.4.2 hMSCs 多向分化潜能
• 2.5 细胞拉伸加载装置
• 2.5.1 细胞拉伸加载装置简介
• 2.5.2 拉伸装置的准备及拉伸测试
• 2.6 分析讨论
• 2.7 本章小结
• 3 机械拉伸诱导hMSCs 向肌腱细胞方向分化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 hMSCs
• 3.2.2 主要仪器、耗材
• 3.2.3 主要实验试剂
• 3.2.4 主要实验试剂的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 hMSCs 机械拉伸加载实验
• 3.3.2 细胞排列夹角测量及分布
• 3.3.3 Real-time RT-PCR
• 3.3.4 Western blot
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 0.1 Hz 机械拉伸对hMSCs 形态、基因表达和蛋白表达的影响
• 3.4.2 1.0 Hz 机械拉伸对hMSCs 形态、基因表达和蛋白表达的影响
• 3.5 分析讨论
• 3.5.1 机械拉伸对hMSCs 形态的影响
• 3.5.2 机械拉伸对hMSCs 分化的影响
• 3.6 本章小结
• 4 机械拉伸诱导hMSCs 向肌腱细胞方向分化的力信号转导
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 hMSCs
• 4.2.2 主要仪器耗材
• 4.2.3 主要实验试剂
• 4.2.4 主要试剂的配制方法
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 细胞形态指数
• 4.3.2 免疫荧光染色
• 4.3.3 hMSCs 机械拉伸加载实验
• 4.3.4 Real-time RT-PCR
• 4.3.5 Western blot
• 4.3.6 抑制剂浓度筛选
• 4.3.7 抑制剂对机械拉伸调节的hMSCs 形态变化的影响
• 4.3.8 抑制剂对机械拉伸诱导的hMSCs 向肌腱细胞方向分化的影响
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 抑制剂浓度筛选
• 4.4.2 Y-27632、细胞松弛素D 和PF 228 对机械拉伸调节的hMSCs 形态变化的影响
• 4.4.3 Y-27632、细胞松弛素D 和 PF 228 对机械拉伸诱导的hMSCs 向肌腱细胞方向分化的影响
• 4.5 分析讨论
• 4.5.1 Y-27632、细胞松弛素D 和PF 228 对机械拉伸调节的hMSCs 形态变化的影响
• 4.5.2 Y-27632、细胞松弛素D 和PF 228 对机械拉伸诱导的FAK 磷酸化的影响
• 4.5.3 Y-27632、细胞松弛素D 和PF 228 对机械拉伸诱导的hMSCs 向肌腱细胞方向分化的影响
• 4.6 本章小结
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录