促红细胞生成素联合粒细胞集落刺激因子治疗急性心肌梗死的实验研究

论文摘要

目的:通过研究EPO联合G-CSF对缺氧心肌细胞以及急性心肌梗死的大鼠动物模型心脏结构和功能的影响,探讨EPO联合G-CSF治疗对急性心肌梗死造成的左室重塑和心功能下降的改善作用以及可能的分子机制,从而为急性心肌梗死的治疗提供新的思路。方法:采用胰酶消化法分离乳鼠心肌细胞并对分离细胞进行传代。采用95%N2+5%CO2气体充分置换的1%的胎牛血清DMEM培养液培养24h,建立缺氧心肌细胞模型。研究不同浓度的EPO和G-CSF对缺氧心肌细胞的保护作用。研究最佳治疗浓度时,EPO、G-CSF和联合治疗对缺氧心肌细胞的保护作用。采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的存活率、凋亡率和坏死率。将心肌细胞分为5组,正常对照组、缺氧组、缺氧+EPO组、缺氧+G-CSF组和缺氧+EPO+G-CSF组。建立缺氧模型24h后收集5组心肌细胞标本。采用Northern-blot方法检测各组心肌细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达,采用Western-blot方法检测各组心肌细胞中的Cyt C、STAT-3、Caspase-3蛋白的表达。采用结扎冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死动物模型。实验动物分为5组:假手术组、心肌梗死组、心梗+EPO组、心梗+G-CSF组和心梗+EPO+G-CSF组。第1d、7d、28d时收集血液标本,检测血常规和生化学指标。建立模型后第1d、7d时收集心脏标本,采用Northern-blot方法检测各组梗死区和梗死周围区组织中的Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达;采用Western-blot方法检测Cyt C、STAT-3、Caspase-3蛋白的表达;采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;采用HE染色观察心肌组织形态;第28d时收集心脏标本,行HE染色、Masson三色染色、天狼猩红胶原染色和Ⅷ因子染色,观察心肌梗死区和梗死周围区心肌组织存活、瘢痕形成、胶原沉积、血管新生情况。第7d和28d时行超声心动图检查评价心脏结构和心功能,第28d时行血流动力学检查评价心功能。结果:成功分离了乳鼠心肌细胞并进行传代。成功建立了心肌细胞缺氧模型。缺氧心肌细胞死亡率和凋亡细胞在总坏死细胞中比例明显高于正常心肌细胞（26.73%vs.5.63%,70.05%vs.37.83%,P＜0.001）。1U/ml EPO开始发挥对缺氧心肌细胞的保护作用,5U/ml、25U/ml和125U/ml的保护作用相似;6ng/ml G-CSF开始发挥对缺氧心肌细胞的保护作用,150ng/ml保护作用最强、30ng/ml和750ng/ml保护作用相似。EPO、G-CSF和联合给药明显减少缺氧心肌细胞的凋亡率和总死亡率（18.73%vs.6.01%vs.7.08%vs.4.57%,P＜0.001;26.73%vs.9.54%vs.11.6%vs.8.15%,P＜0.001）;EPO与G-CSF组保护作用相近（P＞0.05）;联合给药组保护作用明显强于单独EPO（P＜0.001）与G-CSF（P＜0.001）给药组。与缺氧组相比:EPO组和G-CSF组Bcl-2 mRNA表达增加（P＜0.01）,BaxmRNA、Caspase-3 mRNA和Caspase-3蛋白表达减少（P＜0.01）,联合治疗组作用最明显,强于单独药物治疗组（P＜0.01）,而EPO和G-CSF组之间无明显差异（P＞0.05）;EPO组Cyt C蛋白表达略低（P＞0.05）,G-CSF组和联合治疗组明显降低（P＜0.05）;联合治疗组,STAT-3蛋白表达增高（P＜0.01）。血常规和生化学指标检测显示:5组动物的血常规检测在建模后第7d、28d没有显著性差异（P＞0.05）。建模后第1d、7d、28d时5组动物的CRE、BUN未见显著差异（P＞0.05）。给予EPO和G-CSF治疗,心肌梗死后第1d,ALT、AST、CK、CK-MB、TNT的表达降低（P＜0.01）;心肌梗死后第7d,CK、CK-MB、TNT的表达降低（P＜0.01）,联合治疗组降低最多（P＜0.01）。心肌梗死后第1d时,EPO和G-CSF组Bcl-2 mRNA的表达增加（P＜0.01）;Bax mRNA（P＜0.01）和Caspase-3 mRNA的表达减少（P＜0.01）;联合治疗效果更为明显,优于EPO和G-CSF单独治疗（P＜0.01）。第7d时Bcl-2,BaX,Caspase-3 mRNA的表达趋势与第1d时相似,但是表达水平明显低于第1d（P＜0.01）。心肌梗死后第1d时,EPO和G-CSF组Cyt C和Caspase-3蛋白表达减少（P＜0.01）;STAT-3蛋白表达增加（P＜0.01）;联合治疗效果更为明显,优于EPO和G-CSF单独治疗（P＜0.01）。第7d时各组蛋白表达趋势与第1d时相似,表达水平明显下降（P＜0.01）。超声心动图检查显示:第7d时所有药物干预组的LVEF和FS增高（P＜0.01）;联合治疗组心功能改善最为明显（P＜0.01）;LVESD和LVESV降低明显（P＜0.01）。第28d时所有药物干预组的LVEF和FS明显增高（P＜0.01）;联合治疗组心功能改善最为明显（P＜0.01）,高于单独药物治疗组（P＜0.01）;所有药物干预组的LVESD、LVEDD、LVESV、LVEDV降低明显（P＜0.01）。血流动力学分析显示:所有药物干预组的LVEDP都降低,LVSP和+dP/dtmax均增高,大鼠心脏的收缩和舒张功能均得到了改善。联合治疗组心功能改善最为明显（P＜0.01）。心肌梗死后第1d时,心肌梗死组中即有大量的凋亡细胞,明显高于EPO组和G-CSF组,联合治疗组凋亡细胞数量最少（P＜0.01）。第7d时,凋亡细胞数量分布的趋势与第1d时相同,凋亡细胞数量较第1d时明显减少。心肌梗死后第28d时,Ⅷ因子染色显示,药物治疗组梗死区和梗死周围区血管增生明显增多（P＜0.01）,联合治疗组新生血管数量最多（P＜0.01）。Masson染色显示,药物治疗组梗死区和梗死周围区纤维瘢痕形成减少,联合治疗组纤维瘢痕形成最少。天狼猩红染色显示,药物治疗组梗死区和梗死周围区胶原沉积减少,联合治疗减少最明显。HE染色显示:药物治疗组残存的心肌细胞增加、纤维瘢痕组织减少,联合治疗组最明显。结论:5U/ml的EPO和30ng/ml的G-CSF是其发挥心肌细胞保护作用的最佳浓度。EPO、G-CSF联合给药对缺氧心肌细胞的保护作用明显强于单独的EPO或G-CSF治疗。缺氧心肌细胞中,EPO增加Bcl-2和STAT-3表达,减少Bax和Caspase-3的表达,说明其可能通过JAK-STAT途径发挥抗凋亡的作用。G-CSF轻度增加STAT-3表达,增强Bcl-2表达,减少Bax、Cyt C和Caspase-3的表达,说明G-CSF可能主要通过线粒体途径,部分通过JAK-STAT途径发挥抗凋亡的作用。EPO联合G-CSF治疗,明显增加STAT-3和Bcl-2的表达,明显减少Bax、Cyt C和Caspase-3的表达,反映可能通过线粒体途径和JAK-STAT途径联合发挥更强的抗凋亡的作用。EPO联合G-CSF治疗在动物体内安全可行,可能通过JAK-STAT途径和线粒体途径,发挥抗心肌细胞凋亡的作用,动物体内的作用更为明显,2条通路的协同放大作用更强。EPO联合G-CSF治疗,可以明显抑制心肌细胞凋亡、减少胶原组织沉积、促进血管新生,从而达到阻止梗死后左室重塑、改善心脏收缩和舒张功能的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 乳鼠心肌细胞的分离培养及EPO联合G-CSF对乳鼠缺氧心肌细胞的保护作用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 乳鼠心肌细胞的分离培养及缺氧模型的建立
• 2.2 不同浓度的EPO和G-CSF对缺氧心肌细胞的保护作用
• 2.3 EPO联合G-CSF对乳鼠缺氧心肌细胞的保护
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二部分 EPO联合G-CSF对乳鼠缺氧心肌细胞的保护机制探讨
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2.结果
• 2.1 EPO联合G-CSF对缺氧心肌细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达的影响
• 2.EPO联合G-CSF对缺氧心肌细胞CytC、STAT-3和Caspase-3蛋白表达的影响
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 第三部分 EPO联合G-CSF治疗急性心肌梗死的实验研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料、仪器和试剂
• 1.2.实验方法
• 2.结果
• 2.1 心肌梗死模型建立及梗死心脏大体形态观察
• 2.2 血液标本检测结果
• 2.3 Northern blot检测组织Bcl-2,Bax,Caspase-3 mRNA的表达
• 2.4 Western blot检测组织CytC,STAT-3,Caspase-3蛋白的表达
• 2.5 超声心动图检测结果
• 2.6 血流动力学检测结果
• 2.7 免疫组织化学染色切片表现
• 2.8 病理学染色切片表现
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 缩略语表
• 攻读博士期间发表论文
• 致谢