论文摘要
牙周病是以牙周袋形成和牙槽骨吸收为特点的细菌感染性炎性疾病,其特征是牙周支持组织（牙槽骨,牙骨质和牙周韧带）的炎症和破坏,而牙周病治疗的一个重要方面是修复牙周缺损并重建正常的结构和功能。真正意义上的牙周再生应该是对发育过程中胚胎发生和形态发生的重演,这需要牙周组织中的大部分甚至全部细胞成份的参与,并依赖于细胞与分子、细胞与细胞、以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。为了在牙周治疗过程中准确地模拟这一复杂精细的过程,需要对牙周组织发育的细胞生物学和分子生物学做更深入细致的研究。一般认为,牙周组织是由环绕牙胚周围的疏松结缔组织一牙囊分化而来。研究表明,牙囊细胞贴壁生长,并有集落形成能力,其表面有公认的干细胞表面标志物的表达,提示了牙囊细胞中间充质干细胞的存在。然而,目前关于牙周组织发育的细胞学机制尚存在争议,而对发育过程中分子生物学机制的研究也比较少。因此,分离培养牙囊中的间充质干细胞对研究牙周组织的发育过程和参与这一过程的调控因子有至关重要的作用。由牙囊发育为成熟牙骨质、牙周韧带以及固有牙槽骨是一个复杂的经过精细调控的过程,这其中涉及了多种细胞的分化以及多种因子的次序表达。一些在骨组织分化过程中起重要作用的基因也在牙齿的发育过程中起重要的作用。Satb2是新近发现的特殊富含AT序列结合蛋白家族的成员,它可结合到核基质结合区（MARs）并以MAR依赖的方式激活基因转录过程。Satb2基因敲除小鼠出生后即死亡,其胚胎表现出多种与人类Satb2基因易位相似的颌面部畸形以及成骨细胞分化和功能上的缺陷。Satb2可正向调节多种成骨细胞的特异性基因如BSP和OCN的表达,同时抑制骨形成的抑制因子和腮弓塑型的调节因子Hoxa2的表达。Satb2还可直接与成骨分化的重要调控因子Cbfa1/Runx2以及ATF4直接结合并通过协同作用增强和放大这些成骨分化调控因子的活性。因此,Satb2是一个强大的成骨诱导因子,它作为一个平台协调其他转录因子的功能,从而在颌面部创伤的修复重建过程中也可能起重要的作用。然而,作为一个新近发现但在成骨分化和骨骼塑型中起重要作用的基因,Satb2在牙齿发育过程中的具体作用尚无明确报道。核心结合因子a1/Runt相关转录因子2（core-bindingfactor a1/runt-related transcription factor 2,Cbfa1/Runx2）属于Runx-domain基因家族,在成骨分化的众多调控因子当中,Runx2被认为是成骨细胞分化的主宰基因（master gene）,在Runx2基因敲除的小鼠中成熟的成骨细胞和骨化完全缺失,仅能观察到一些只微弱表达ALP活性而不不表达骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和骨钙素（osteocalcin,OC）的不成熟成骨细胞。虽然大量证据表明了Satb2和Runx2在成骨分化和骨组织发生等过程中的重要作用,但由于这些基因在胚胎发育的早期起至关重要的作用,使得相应的基因敲除小鼠出现非常严重的表型,以至于造成新生鼠的立即死亡,这些现状给深入探讨这些基因在牙根发育过程中的作用增加了难度。此外,对Satb2和Runx2在牙周创伤修复过程中促进细胞分化和组织再生的作用还需要进一步研究。本研究在体外分离培养并鉴定牙囊细胞分化潜能的基础上,研究了Satb2在牙囊细胞向成骨细胞分化过程中的作用,并通过体内牙周创伤模型明确了牙囊细胞、骨髓基质细胞以及Satb2和Runx2在牙周组织修复过程中的作用,以期为牙周组织工程学筛选促进牙周再生的种子细胞和调控因子提供新的理论依据。材料和方法:第一部分:本实验使用的转基因小鼠mBSP9.0Luc/BACT-EGFP携带的外源性基因是小鼠BSP上游9.0 kb启动子序列调控的荧光素酶报告基因和β-肌动蛋白（β-actin）启动子及巨细胞病毒增强子（cytomegalovirus enhancer）调控的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）。从已鉴定的5-7天龄的mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠中分离牙囊细胞,传代培养。在体外以10-8mol/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠、50mg/l维生素C)诱导牙囊细胞向成骨细胞的分化,以茜素红染色法检测钙化结节的形成;以10-8M地塞米松和6ng/ml胰岛素诱导牙囊细胞向脂肪细胞分化,并用油红O（Oil Red O）染色鉴定;以10-8mol/L地塞米松、10mmol/L维生素C和5μg/ml转化生长因子β（TGF-β）诱导牙囊细胞向软骨细胞分化,并以阿利新兰染色鉴定。体外诱导实验均以从6-8周大的mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠中分离的骨髓基质细胞为对照,第二部分:本实验用原位杂交检测了小鼠胚胎14.5天时颌骨和牙胚中Satb2的表达;用脂质体转染的方法将Satb2表达载体pcDNA3.1-Satb2转入骨髓基质细胞和牙囊细胞中以实现Satb2的过表达,并用半定量RT-PCR检测骨特异性基因和成骨分化调控因子的表达;用逆转录病毒（pBABE-hygro-Satb2）感染小鼠成骨细胞系MC3T3,并用迁移速率实验（Scratch wound assay）检测Satb2过表达对细胞迁移速率的影响;为检测Satb2对Osx基因转录活性的调节,将含有Osx全长启动子（-2020/+13）的报告载体与Satb2和/或Runx2表达载体同时转染入HEK-293细胞和MC3T3-E1细胞中,并检测荧光素酶表达水平的变化;用逆转录病毒（pBABE-hygro-Satb2）感染mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠牙囊细胞（DFCs）和骨髓基质细胞（BMSCs）,并将这些细胞植入B6D2F1小鼠的牙周创伤模型中,用H&E染色、免疫组化染色和组织学测量评价Satb2过表达对牙周创伤愈合的作用。第三部分:本实验用H&E染色和组织学测量评价了6-8周的Runx2+/-小鼠和Runx2+/+小鼠的牙周创伤和股骨创伤的愈合情况;用基因激活基质（gene-activated matrix,GAM）将Runx2表达载体pCMV-Osf2/Cbfa1引入7周大的Runx2+/+（野生小鼠）的牙周创区,并用H&E染色,免疫组化染色,组织学测量和半定量RT-PCR评价Runx2过表达对小鼠牙周创伤愈合的作用。结果:第一部分:体外培养的牙囊细胞经过多次传代后,细胞密度增高,细胞的大小和形态接近一致。牙囊细胞和骨髓基质细胞经骨相诱导培养基诱导4周并经茜素红染色后可见致密红染的细胞外基质沉积,牙囊细胞和骨髓基质细胞形成的矿化结节形态并无明显差别,但牙囊细胞形成的矿化结节数量较少,牙囊细胞培养物内的茜素红沉积量也显著低于骨髓基质细胞培养物。经脂肪细胞分化诱导后,牙囊细胞和骨髓基质细胞的形态未发生明显变化。油红O（Oil Red O）染色后两组细胞均可见到阳性染色的脂肪滴形成,但是牙囊细胞培养物中的脂肪滴形成少于骨髓基质细胞培养物,提示前者的成脂肪细胞能力弱于后者。半定量RT-PCR结果显示,牙囊细胞中脂蛋白酯酶（LPL）的表达量显著低于骨髓基质细胞中LPL的表达量。经软骨细胞分化诱导和阿利新兰染色（Alcian blue）后牙囊细胞和骨髓基质细胞培养物内均可见类软骨样嗜阿利新兰染色的基质,但牙囊细胞中阿利新兰染色的强度弱于骨髓基质细胞。用半定量RT-PCR检测小鼠α1（Ⅱ）procollagen表达水平的结果显示,牙囊细胞中α1（Ⅱ）procollagen的表达水平显著低于骨髓基质细胞。第二部分:Satb2在切牙牙胚的间充质成分中高水平表达,但在上皮成分中不表达。同时,Satb2在发育中的颚骨和下颌骨基质中也高水平表达,但在Meckel’s软骨中不表达。在发育中的正在向中线生长的腭突边缘,Satb2的表达尤其强烈。过表达Satb2的骨髓基质细胞中,BSP,Runx2,Osx和VEGFA的表达均增强。BMP4可以诱导Satb2的表达,而KBMP4诱导的骨特异性基因和VEGF的表达模式与Satb2诱导的表达模式不同。Satb2在处于牙根发育阶段的正常小鼠磨牙牙囊细胞中也有表达,而且Satb2在牙囊细胞中的过表达也增强了BSP和Runx2的表达。过表达Satb2的MC3T3细胞中BSP,Osx,Runx2和VEGF的表达均增强。同时,Satb2过表达MC3T3细胞的迁移速率被轻度提高。Satb2在HEK-293细胞和MC3T3-E1细胞中过表达分别将Osx的启动子活性增强了1.6和1.8倍,而Runx2在HEK-293细胞和MC3T3-E1细胞中过表达将Osx启动子活性分别增强了1.8和2.52倍。另外,Satb2可将Runx2的激活效应增强2倍。H&E染色,免疫组化染色和组织学测量结果显示Satb2在牙囊细胞和骨髓基质细胞中过表达促进了成骨细胞分化和牙周手术创伤的愈合。第三部分:H&E染色,免疫组化染色和组织学测量结果表明Runx2基因单倍剂量不足导致小鼠牙周及股骨创区愈合不良,而在野生小鼠牙周创区局部释放Runx2质粒促进了牙周创区的愈合。组织学测量表明术后7天对照组和实验组创伤侧的牙周膜宽度比较非创伤侧均有轻度增宽,但术后14天实验组创伤侧的牙周膜宽度降低,与非创伤侧的牙周膜宽度相比,差别没有统计学意义。RT-PCR和免疫组化染色结果也显示在牙周创区内应用GAM技术导入Runx2表达载体可在术后7天显著增强Runx2在牙周创区内的表达,而在术后14天仍能维持一个较高水平的Runx2表达,同时BSP的表达也得到增强。结论:在本研究中,我们用体外诱导的方法成功诱导了牙囊细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞的分化,进一步证实了牙囊细胞中具有多向分化潜能的干细胞的存在。研究表明,虽然牙囊细胞可以在体外经诱导分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,但牙囊细胞培养物的特殊染色强度均低于骨髓基质细胞培养物,提示牙囊细胞的多向分化潜力弱于骨髓基质细胞,或同样的细胞总数内牙囊细胞中干细胞的比例小于骨髓基质细胞中干细胞的比例。Satb2在颚骨和颌骨基质中的高水平表达证实了Satb2在成骨细胞分化和骨形成过程中的重要作用,而Satb2在腭突边缘的高水平表达也与病案报道和动物研究中Satb2与腭裂相关的结论相一致。Satb2牙胚中的表达模式提示Satb2在牙齿间充质组分如牙本质,牙髓和牙周组织的发育过程中也起一定的作用。Satb2在骨髓基质细胞、牙囊细胞以及小鼠成骨细胞系MC3T3中过表达增强了骨基质蛋白BSP的表达水平,同时也增强了促进成骨的转录因子Runx2和osterix的表达水平。而且,Satb2不仅可以直接促进osterix的表达,而且还可以通过与Runx2的协同作用增强Runx2促进osterix表达的作用。Satb2还增强了血管内皮生长因子VEGFA的表达水平,提示Satb2在组织修复过程中可能还具有促进血管生成的能力。细胞迁移试验结果提示创伤修复过程中,Satb2可能通过促进成骨细胞前体细胞向创区迁移而不断补充衰老和凋亡的成骨细胞和骨细胞,从而达到促进创伤愈合的目的。另外,Satb2基因功能缺陷导致的腭裂也可能与Satb2促进细胞迁移的能力受到影响有关。通过体内实验和牙周创伤模型,我们证实了Satb2在种子细胞（牙囊细胞和骨髓基质细胞）中过度表达促进了牙周创伤的愈合速度,并增强了干细胞向成骨细胞分化的能力。然而,植入牙囊细胞和植入骨髓基质细胞对牙周创伤愈合的促进能力并没有明显的差别。Runx2+/-小鼠中由于Runx2基因的单倍剂量不足造成骨创伤的愈合的延缓,提示Runx2在骨及牙周创伤的修复过程中也起重要作用。而用GAM技术将Runx2cDNA导入并释放到牙周缺损部位后,被牙周创区内的干细胞摄入的Runx2cDNA可在原位表达,促进成骨细胞的分化,增强骨和牙骨质特异性基因—BSP的表达,并进一步促进牙周创区的组织修复和再生。