湖羊BMP4基因克隆、表达与多态性分析

论文摘要

湖羊是我国特有的多胎绵羊品种,其高繁殖力遗传机制尚不明确。骨形态发生蛋白4（BMP4）是转化生长因子β超家族中骨形态发生蛋白亚家族成员,研究表明BMP4与哺乳动物生殖机能密切相关,可促进卵泡发育和卵母细胞成熟,增加排卵数。本研究采用PCR扩增和克隆测序技术获得湖羊BMP4基因DNA序列,利用生物信息学方法对其基因结构、序列和系统发育进行分析；分析了湖羊BMP4基因组织表达特征以及卵巢组织表达水平与湖羊繁殖性能（排卵数和产羔数）的关系；以BMP4作为湖羊高繁性状的候选基因,采用PCR-SSCP对湖羊BMP4基因多态性进行检测,并对不同基因型个体与产羔数进行关联分析,探讨BMP4与湖羊繁殖性能的潜在关系,筛选影响湖羊多胎性状的候选基因,为揭示湖羊高繁机理提供参考。全文结论如下：1.湖羊BMP4基因克隆与序列分析通过PCR扩增和克隆测序获得了湖羊BMP4基因DNA序列,序列全长4694bp。分析发现湖羊BMP4基因由4个外显子和3个内含子组成,其中第1、第2外显子为非编码外显子,编码区序列全长1230bp,由外显子3、4组成,编码409位氨基酸；三级结构预测显示BMP4蛋白存在4个α-螺旋及8个β-折叠结构；BMP4蛋白包含TGFβ-propeptide、TGFβ两个保守结构功能域,TGFβ-propeptide结构域在分布位置及氨基酸序列上高度保守,TGFβ结构域则完全相同；利用BMP4氨基酸序列构建哺乳动物NJ系统发育树,结论与经典分类学相吻合。研究结果表明湖羊BMP4基因与哺乳动物其他物种同源性较高,推测与其他哺乳动物类似,BMP4在湖羊卵泡发育过程中发挥着重要作用。2.湖羊卵巢组织BMP4基因表达水平与繁殖性能相关性分析采用RT-PCR对湖羊BMP4基因进行组织表达特征分析,结果显示BMP4基因在湖羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉等组织中均有表达。采用real-time PCR对湖羊卵巢组织BMP4基因mRNA表达水平进行检测并分析其与繁殖性能（排卵数、产羔数）关系,结果显示湖羊卵巢组织BMP4基因mRNA表达水平与排卵数间呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数为0.8663,基因表达水平（Y）与排卵数（X）线性回归方程为：Y=-0.3213+0.2362X（R2=0.7505）；基因表达水平与第一胎产羔数间呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数为0.8861,建立的线性回归方程为：Y=-0.3701+0.4734X（R2=0.7851）；基因表达水平与第二胎产羔数间呈显著正相关（P<0.05）,相关系数为0.7567,建立的线性回归方程为：Y=0.0291+0.1845X（R2=0.5726）；基因表达水平与平均产羔数间呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数为0.8744,建立的线性回归方程为：Y=-0.1753+0.2862X（R2=0.7645）。研究结果表明BMP4基因与湖羊繁殖性能存在密切关系,可能是湖羊高繁性状的候选基因。3.湖羊BMP4基因多态性与产羔数关联分析采用PCR-SSCP对220头湖羊BMP4基因进行多态性检测,结果发现引物T2在湖羊群体中检测到AA、AB两种基因型,测序结果显示BMP4基因编码区第298位核苷酸发生了A→C碱基突变,并导致湖羊BMP4蛋白第100位氨基酸由异亮氨酸（Ile）转变为亮氨酸（Leu）。在湖羊群体中,AA型为优势基因型,频率为0.7758；A为优势等位基因,频率为0.8794。A298C位点多态性与产羔数关联分析发现,不同基因型间产羔数呈现AA>AB的趋势,其中AA型个体第三胎产羔数和经产平均产羔数分别比AB型个体多出0.86只和0.57只,存在显著性差异（P<0.05）。研究结果表明湖羊BMP4基因编码区A298C突变位点与湖羊产羔数存在密切关联,对湖羊新品系培育和标记辅助育种具有一定意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 湖羊多胎性能研究进展
• 1 湖羊品种简介
• 1.1 来源与分布
• 1.2 体型外貌
• 1.3 肉用性能
• 1.4 皮毛性能
• 1.5 繁殖性能
• 2 湖羊多胎性能生理机制研究进展
• 2.1 生殖器官特点研究
• 2.2 发情排卵与生殖内分泌特点研究
• 3 湖羊多胎性能遗传机制研究进展
• 3.1 BMPR-IB
• 3.2 BMP15
• 3.3 GDF9
• 3.4 ESR、GnRHR、LHβ、BMPRIA
• 参考文献
• 第二章 BMP4基因研究进展
• 1 骨形态发生蛋白（BMP）简介
• 1.1 BMP成员
• 1.2 BMP基因结构
• 1.3 BMP信号传导
• 2 BMP4研究进展
• 2.1 BMP4基因及蛋白结构
• 2.2 BMP4作用机制
• 2.3 BMP4生物作用
• 2.4 BMP4基因多态性研究
• 参考文献
• 第二部分 试验研究
• 第三章 湖羊BMP4基因克隆与序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 组织样DNA提取
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 PCR扩增
• 1.6 PCR产物回收及测序
• 1.7 生物软件及在线分析工具
• 2 结果与分析
• 2.1 湖羊BMP4基因序列扩增
• 2.2 湖羊BMP4基因克隆与鉴定
• 2.3 湖羊BMP4基因基因组结构分析
• 2.4 湖羊BMP4基因5’端序列分析
• 2.5 湖羊BMP4氨基酸序列及理化性质分析
• 2.6 湖羊BMP4蛋白结构预测
• 2.7 哺乳动物BMP4进化及系统发育分析
• 3 讨论
• 3.1 湖羊BMP4基因序列特征
• 3.2 BMP4蛋白结构分析
• 3.3 BMP4基因序列变异及系统发育分析
• 参考文献
• 第四章 湖羊卵巢组织BMP4表达水平与繁殖性能关系
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 组织样RNA提取及cDNA合成
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 PCR反应条件
• 1.6 荧光实时定量PCR
• 1.7 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 湖羊组织RNA提取结果
• 2.2 湖羊BMP4及β-actin基因RT-PCR扩增结果
• 2.3 湖羊BMP4基因组织表达谱分析
• 2.4 湖羊卵巢组织BMP4表达水平与排卵数、产羔数相关分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 湖羊BMP4基因多态性与产羔数关联性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 组织样DNA提取
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 PCR反应及扩增产物处理
• 1.6 PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.7 基因多态性指标统计分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 湖羊基因组DNA提取结果
• 2.2 PCR产物扩增
• 2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析
• 2.4 湖羊BMP4基因编码区A298C位点多态性分析
• 2.5 湖羊BMP4基因编码区A298C位点多态性与产羔数关联分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 全文创新点
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录