论文题目: 水稻Ca～（2+）/H～+反向转运体OsCAX3的功能、表达特性及调控序列研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 祁碧菽
导师: 王学臣
关键词: 反向转运体,水稻,亚细胞定位
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: Ca2+在植物中具有非常重要的作用,它既是植物必需的营养元素,又是植物响应体内发育信息和外部刺激的重要信使。为了保持体内的Ca2+平衡,植物必须通过Ca2+转运系统来完成对Ca2+的运输。Ca2+/H+反向转运体作为一类Ca2+外向转运器,在植物的营养和信号转导中起着非常重要的作用:使胞内Ca2+浓度处于静息水平,终止Ca2+信号;将Ca2+储存进内质网、液泡等细胞器,作为信号转导中的Ca2+源来调控Ca2+的释放;将Ca2+正确分配到各细胞器中,从而确保各种特异生化反应的顺利进行。水稻既是一种重要的粮食作物,又是生物学研究的模式植物,因此,对于水稻Ca2+/H+反向转运体具有理论和实践的双重意义。 本文对水稻的Ca2+/H+反向转运体OsCAX3进行了研究。我们首先克隆了该基因,序列分析发现OsCAX3具有11个的跨膜区,是一个膜蛋白,它与其它Ca2+/H+反向转运体有很高的同源性。 用RT-PCR的方法研究了OsCAX3在水稻中的表达特性,OsCAX3在水稻幼苗的根和叶中都有表达,表达量差别不大。OsCAX3在RNA水平上受到外源Ca2+的强烈诱导,K+、Na+、Mg2+和4℃处理后,可轻微诱导OsCAX3表达,而Mn2+和PEG的处理则使OsCAX3的表达轻微降低。 利用PSORT Prediction进行亚细胞定位预测分析发现OsCAX3定位于植物细胞质膜,为了验证这一结果,我们构建了OsCAX3-GFP瞬时表达载体和稳定表达载体,分别转化拟南芥叶肉细胞原生质体和烟草,结果显示OsCAX3-GFP定位在拟南芥原生质体细胞膜和转基因烟草表皮细胞膜以及表皮毛细胞膜上。 转化酵母突变体K667显示OsCAX3具有转运Ca2+的功能,但不能转运Mn2+、Cu2+、Ni2+、Na+、Zn2+。我们利用转基因烟草研究了OsCAX3在植物中的功能。OsCAX3过表达转基因烟草与野生型烟草在pH5.7的1/2MS培养基上和加入100mM CaCl2、pH5.7的1/2MS培养基上生长没有差别,植株中的Ca2+含量也差别不大。但在含100mM CaCl2、pH7.2的1/2MS培养基上,转基因烟草的生长好于野生型,而且植株的Ca2+含量少于野生型植株中的Ca2+含量。 在对OsCAX3转运Ca2+功能的调控研究中发现,OsCAX3的N端1-26个氨基酸参与了OsCAX3转运Ca2+功能的调控。
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 钙转运系统
1.1.1 Ca~(2+)外向转运系统
1.1.2 钙离子内向转运系统—Ca~(2+)通道
1.2 钙信号
1.3 Ca~(2+)转运系统在植物营养元素分配中的作用
1.4 选题题依据和意义
第二章 水稻Ca~(2+)／H~+反向转运体基因OsCAX3的克隆及序列分析
2.1 材料与方法
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株与质粒
2.1.3 主要仪器
2.1.4 所需试剂
2.1.5 TRlzol试剂提取总RNA
2.1.6 异硫氰酸胍法
2.1.7 反转录cDNA的合成
2.1.8 PCR扩增目的片段
2.1.9 PCR产物的回收和纯化
2.1.10 提取质粒DNA
2.1.11 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.1.12 细菌的转化
2.1.13 重组质粒的鉴定
2.2 结果与分析
2.2.1 水稻Ca~(2+)／H~+反向转运体基因OsCAX3的克隆
2.2.2 OsCAX3与其它反向Ca~(2+)／H~+转运体的氨基酸序列同源性分析
2.2.3 水稻OsCAX3亲水性分析及跨膜区预测
2.3 讨论
第三章 OsCAX3表达特性和亚细胞定位分析
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料和细菌菌株
3.1.2 质粒载体
3.1.3 试剂
3.1.4 所用仪器
3.1.5 水稻幼苗的处理
3.1.6 RT-PCR
3.1.7 瞬时表达载体和稳定表达载体的构建
3.1.8 质粒DNA的提取
3.1.9 W5溶液的配置
3.1.10 拟南芥叶肉细胞原生质体的提取和转化
3.1.11 农杆菌感受态细胞的制备
3.1.12 植物表达载体转化农杆菌
3.1.13 阳性克隆的鉴定
3.1.14 烟草转化
3.1.15 基因组DNA的提取(SDS法)
3.1.16 PCR鉴定
3.1.17 荧光的观察
3.2 结果与分析
3.2.1 OsCAX3在水稻不同组织中的表达特性
3.2.2 外源Ca~(2+)对OsCAX3表达的诱导
3.2.3 外源K~+、Na~+、Mn~(2+)、Mg~(2+)、PEG和4℃对OsCAX3表达的诱导
3.2.4 pBI221-OsCAX3-GFP瞬时表达载体的构建
3.2.5 pEZTNL35S-OsCAX3-GFP稳定表达载体的构建
3.2.6 OsCAX3-GFP定位在拟南芥叶肉细胞原生质体的质膜上
3.2.7 OsCAX3-GFP定位在转基因烟草的表皮细胞的细胞膜上
3.3 讨论
3.3.1 OsCAX3的表达特性
3.3.2 OsCAX3的亚细胞定位
第四章 OsCAX3转基因酵母的功能分析
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株和载体
4.1.2 培养基
4.1.3 主要试剂
4.1.4 主要仪器
4.1.5 酵母表达载体的构建
4.1.6 酵母感受态的制备
4.1.7 酵母的转化
4.1.8 酵母质粒的提取
4.1.9 阳性酵母菌落的鉴定
4.1.10 酵母的Ca~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)、Na~+、Zn~(2+)耐受性分析
4.1.11 酵母在培养液中的Ca~(2+)耐受性分析
4.2 结果与分析
4.2.1 pYES2-OsCAX3酵母表达载体的构建与鉴定
4.2.2 转基因酵母阳性菌株质粒PCR鉴定
4.2.3 OsCAX3转基因酵母在培养基中的Ca~(2+)、Mn~(2++)耐受性分析
4.2.4 OsCAX3转基因酵母在培养基中的Cu~(2+)、Ni~(2+)、Na~+、Zn~(2+)耐受性分析
4.2.5 OsCAX3转基因酵母在培养液中的Ca~(2+)耐受性分析
4.3 讨论
4.3.1 酵母液泡膜上的Ca~(2+)转运体器
4.3.2 用酵母突变体研究Ca~(2+)／H~+反向转运体的功能
4.3.3 OsCAX3的离子转运特异性
第五章 OsCAX3转基因烟草的表型分析
5.1 材料与方法
5.1.1 植物材料
5.1.2 工程菌与质粒载体
5.1.3 工具酶及主要试剂
5.1.4 常用培养基
5.1.5 重组表达载体pBI121-OsCAX3的构建与鉴定
5.1.6 植物表达载体转化农杆菌
5.1.7 阳性克隆的鉴定
5.1.8 用于转化烟草的农杆菌菌液的准备
5.1.9 烟草的转化(同3.1.13)
5.1.10 转基因烟草Ca~(2+)耐受性分析
5.1.11 烟草中Ca~(2+)含量的测定
5.2 结果与分析
5.2.1 pBI121-OsCAX3的构建与鉴定
5.2.2 pBI121-OsCAX3转化农杆菌
5.2.3 pBI121-OsCAX3转化烟草及阳性苗鉴定
5.2.4 烟草的Ca~(2+)的耐受性分析
5.2.5 烟草中Ca~(2+)含量的测定
5.3 讨论
第六章 N端参与了OsCAX3的Ca~(2+)转运功能的调控
6.1 材料与方法
6.1.1 菌株和载体
6.1.2 OsCAX3 N端序列的分析
6.1.3 s10sCAX3、s20sCAX3、s30sCAX3 cDNA片段的获得
6.1.4 酵母表达载体的构建，酵母感受态细胞的制备以及酵母的转化
6.1.5 酵母的Ca~(2+)耐受性分析
6.2 结果与分析
6.2.1 OsCAX3 N端序列的分析
6.2.2 pYES2-s10sCAX3、pYES2-s20sCAX3、pYES2-s30sCAX3载体的构建和鉴定
6.2.3 转基因酵母阳性斑的PCR鉴定
6.2.4 转基因酵母的Ca~(2+)耐受性分析
6.3 讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-07-18
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