一种α1珠蛋白基因突变异常血红蛋白G复合HbH(-α4.2/SEA)病的研究

论文摘要

研究背景及目的异常血红蛋白病（Abnormal hemoglobinopathies）属于常染色体显性遗传遗传疾病，珠蛋白肽链结构异常导致一种或一种以上结构异常的血红蛋白，部分或完全替代了正常的血红蛋白。肽链结构改变可导致血红蛋白功能和理化性质的变化或异常。结构异常可发生于任何一种珠蛋白链，但以β珠蛋白链受累为常见，异常血红蛋白病的蛋白表型均以其基因突变为基础。文献已报道的异常血红蛋白已达1021种，涉及不同的珠蛋白链。多数变种仅为携带者的遗传特性，少数变种则可引起临床症状从而影响患者的健康。血红蛋白G病（Hb G disease）属于异常血红蛋白病范围，于1954年由Edington和Lehamann第一次报导，其正常的血红蛋白为异常的血红蛋白完全或部分替代。血红蛋白G在过去的大规模血红蛋白普查中偶有发现，是一种少见的异常血红蛋白。目前已知HbG病主要是由于α链或β链异常所致，文献报道属α链异常的有HbGTaichung（常称HbQThailand）、HbGAudbaii和HbG Chinese等8种，属β链异常的有HbG Taipei、HbG Coushatta等14种。HbG病的发生与民族、地域有关，中国人以HbGTaichung、HbG Chinese、HbG Taipei和HbG Coushatta为主，HbGCoushatta以北方居多。多数异常血红蛋白G病无临床症状， HbG病分子异质性相当明显，包含多种类型的变异，通常按异常肽链一级结构分析进行分类。我国八、九十年代主要运用肽链氨基酸指纹图谱法进行氨基酸序列分析，目前国外常用高压液相色谱仪、毛细血管电泳等方法进行珠蛋白肽链分析鉴定异常血红蛋白类型。本课题通过血液学检查、高分辨琼脂糖凝胶电泳、珠蛋白α、β基因DNA测序的方法，对血红蛋白G病的血液学表现、分子生物学特点、珠蛋白基因突变进行分析，同时运用Gap-PCR法、反向斑点杂交法进行地中海贫血基因检测。确定本两例血红蛋白G基因突变类型，以及复合地中海贫血的分子基础。为异常血红蛋白G的临床、分子遗传学研究，提供更多的科学实验和理论依据。材料与方法研究对象患者王某某，女，41岁，广东珠海人。从幼年时期反复巩膜黄染，有胆囊炎、胆囊结石病史，体检发现巩膜轻度黄染，肝肋下未及、脾下缘在肋缘下约2cm。检查报告显示：血常规：Hb97.8g/L，MCV63.8fL，MCH18.8pg，MCHC295.0g/L；血液检查：血清铁42umol/L，谷丙转氨酶（ALT）60u/L,谷草转氨酶（AST）57U/L,总胆红素（TBIL）30.9umol/L，结合胆红素（DBIL）10.6umol/L，非结合胆红素（IBIL）20.3umol/L；血红蛋白琼脂糖凝胶电泳：血红蛋白A缺如，血红蛋白F2.0%，血红蛋白A20.3%，血红蛋白G87.6%，血红蛋白H10.1%。红细胞脆性22.9%。患者肖某某，女，32岁，广东韶关人。体检发现中度贫血貌，肝脾肋下未及，血常规：Hb84g/L，MCV61fL，MCH19.8pg，MCHC325g/L；血液检查：血清铁21umol/L，谷丙转氨酶（ALT）13u/L,谷草转氨酶（AST）26U/L,总胆红素（TBIL）13umol/L，结合胆红素（DBIL）6.4umol/L，非结合胆红素（IBIL）6.6umol/L；血红蛋白琼脂糖凝胶电泳：血红蛋白A缺如，血红蛋白F1.0%，血红蛋白A20.5%，血红蛋白G81.0%，血红蛋白H17.5%。红细胞脆性7.9%。实验方法血液学检验红细胞参数分析采用雅培CD-3700全自动血细胞分析仪进行检测，血红蛋白电泳分析采用法国Sebia全自动电泳仪。血清铁、肝功能采用日立7170s全自动生化分析仪。DNA基因分析1.采用苯酚∶氯仿∶异戊醇法提取外周血DNA。2.对α链和β珠蛋白基因进行DNA测序。3.采用PCR和反向斑点杂交法检测地贫基因。结果血液学分析结果患者王某某，血常规表现为小细胞低色素贫血（Hb97.8g/L，MCV63.8fL，MCH18.8pg,MCHC295.0g/L），红细胞脆性为22.9%，较正常明显下降。琼脂糖凝胶电泳发现异常血红蛋白G87.6%，血红蛋白A缺如，血红蛋白A20.3%，血红蛋白H10.1%。。血清铁偏高42umol/L。谷丙转酶（ALT）60u/L,谷草转氨酶（AST）57U/L,总胆红素（TBIL）30.9umol/L，结合胆红素（DBIL）10.6umol/L，非结合胆红素（IBIL）20.3umol/L。患者肖某某，血常规表现为小细胞低色素贫血（Hb84g/L，MCV61fL，MCH19.8pg,MCHC325g/L），红细胞脆性为7.9%，较正常明显下降。琼脂糖凝胶电泳发现异常血红蛋白G81.0%，血红蛋白A缺如，血红蛋白A20.5%，血红蛋白H17.5%。血清铁正常21umol/L。谷丙转氨酶（ALT）13u/L,谷草转氨酶（AST）26U/L,总胆红素（TBIL）13umol/L，结合胆红素（DBIL）6.4umol/L，非结合胆红素（IBIL）6.6umol/L。DNA基因分析结果采用苯酚：氯仿：异戊醇法提取两例患者外周血DNA，对α、β珠蛋白基因进行DNA测序，均发现α1珠蛋白基因外显子2第128位G→C，密码子GAC→CAC，即α链N端的第74位天冬氨酸被组氨酸取代（Asp→His），为HbG Taichung（α274Asp→His β2）。α1的外显子1、3无异常。β珠蛋白基因外显子1、2和3均无异常。对两患者DNA进行α地中海贫血SEA、3.7、4.2缺失基因分别进行PCR检测，均检出α地中海贫血SEA缺失杂合子和4.2缺失杂合子。对β地中海贫血基因突变位点：-29，-28、17、βE、41/42、43、71/72/654、Int、14/15、27/28、I-1、I-5、31采用反向斑点杂交（RBD）基因诊断未检出突变基因，发现两患者为中间型α地中海贫血HbH(--/-α4.2)。结论1.高分辨琼脂糖凝胶电泳是发现异常血红蛋白G的有效方法。电泳图谱表现出优势的血红蛋白G带并缺乏血红蛋白A带类型，可能是基因突变纯合子或杂合子同时复合地中海贫血基因突变，本两例经分子生物学分析证实为杂合子同时复合血红蛋白H(--/-α4.2)基因突变，提示血红蛋白G突变须作进一步DNA基因分析明确其突变类型。2.分子生物学DNA测序，能准确检测出血红蛋白G基因突变，是确诊异常血红蛋白G类型的直接证据。3. HbG Taichung是异常血红蛋白G的特殊类型，复合地中海贫血，引发临床症状。4.血红蛋白G病是一组高度异质性疾病，其血液学、分子生物学、基因突变、临床特点具有多样性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 研究对象
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 血液常规、生物化学检查及脆性试验
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3 外周血 DNA 提取
• 2.2.4 模板 DNA 的鉴定
• 2.2.5 PCR 扩增及测序
• 2.2.6 α地中海贫血基因检测
• 2.2.7 β地中海贫血基因检测
• 实验结果
• 3.1 实验室检查结果
• 3.2 血红蛋白琼脂糖凝胶电泳结果
• 1及其外显子的 PCR-琼脂糖凝胶电泳结果'>3.3 α₁及其外显子的 PCR-琼脂糖凝胶电泳结果
• 3.4 β珠蛋白基因外显子的 PCR-琼脂糖凝胶电果
• 1珠蛋白基因及α₁外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果'>3.5 王某某α₁珠蛋白基因及α₁外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果
• 1珠蛋白基因及α₁外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果'>3.6 肖某某α₁珠蛋白基因及α₁外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果
• 3.7 β外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果
• 3.8 α地中海贫血基因检测结果
• 3.9 β地中海贫血基因检测结果
• 讨论
• 4.1. HbG 临床特点
• 4.2 异常血红蛋白的分子结构和遗传基础
• 4.3 血红蛋白 G 的发生特征
• 4.4 血液学表现
• 4.5 血红蛋白 G 的理化性质
• 4.6 血红蛋 G 基因及遗传规律
• 结论
• α和β珠蛋白基因结构图
• 中英文缩略词表
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在校期间发表的论文
• 致谢