Rhizoctonia sp. SYBC-M3产锰过氧化物酶发酵条件优化及酶学性质研究

论文摘要

锰过氧化物酶是木质素降解的关键酶之一,底物专一性弱,具有氧化降解各类芳香族化合物的独特能力,在纸浆的生物漂白等方面得到了较多的研究与应用。但锰过氧化物酶的合成目前似乎只限于担子菌类,而且还处于实验室阶段,因此筛选出具有良好产锰过氧化物酶能力的菌株资源并研究其酶学性质,对于增加菌株资源和获得潜在应用具有一定意义。论文从自然界中筛选得到一株产锰过氧化物酶的真菌,通过形态和分子鉴定,确定其为丝核菌属,定名为Rhizoctonia sp. SYBC-M3。论文研究了不同碳源、氮源、表面活性剂和诱导剂对Rhizoctonia sp. SYBC-M3锰过氧化物酶产生的影响。采用单因素法和正交实验对Rhizoctonia sp. SYBC-M3摇瓶培养基进行了优化,优化后的培养基为:豆粕20 g/L,蛋白胨10 g/L,Tween-20 0.5 g/L, Mn2+ 1.5 mmol/L,起始pH 4.5,MnP的活有了较大程度的提高,可达2,759 U/L;粗酶的最适作用温度55℃,最适pH 5.0;同时其温度和pH稳定性也较好。pH 9.0下24 h还可保持90%以上的活性。采用DEAE-离子层析、Sephadex G-100凝胶过滤等方法纯化了Rhizoctonia sp. SYBC-M3的MnP。纯化的MnP较Rhizoctonia sp. SYBC-M3粗酶纯化了12.6倍,回收率为38.64%。纯化的MnP在50 mmol/L丙二酸缓冲液中以Mn2+和H2O2为底物测定的最适反应pH为4.5;在pH 4.07.0范围表现比较稳定;最适作用温度为55℃;MnP在50℃以下性质稳定,在60℃的环境中失活迅速。Zn2+、Ca2+和Mg2+对酶活有促进作用;Fe3+、Cu2+和Co3+对酶活有不同程度的抑制作用。测定MnP两种底物的Km值及Vmax:MnP对于底物H2O2的Km值为25.3μmol/L,最大反应速度Vmax为537 U/mg·蛋白, MnP对于底物Mn2+的Km值为53.9μmol/L,最大反应速度Vmax为748 U/mg·蛋白;同时测定以ABTS、DMP、黎芦醇和愈创木酚为底物时MnP都有酶活,且对后三种底物有较高酶活。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 木质素简介
• 1.1.2 白腐真菌的研究进展
• 1.1.3 锰过氧化物酶
• 1.2 研究内容
• 1.2.1 产锰过氧化物酶微生物筛选及初步鉴定
• 1.2.2 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产锰过氧化物酶培养基的优化
• 1.2.3 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶的分离纯化
• 1.2.4 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶的酶学性质研究
• 第二章 产锰过氧化物酶微生物筛选及初步鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 主要仪器和设备
• 2.2.5 产锰过氧化物酶微生物的筛选
• 2.2.6 锰过氧化物酶活的测定
• 2.2.7 菌株的鉴定
• 2.2.8 SYBC-M3 锰过氧化物酶粗酶的部分酶学特性研究
• 2.3 结果
• 2.3.1 产锰过氧化物酶微生物的筛选
• 2.3.2 SYBC-M3 菌株的鉴定
• 2.3.3 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶粗酶的酶学特性
• 2.4 讨论
• 第三章 Rhizoctonia sp. SYBC-M3产MnP培养基的优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 培养基
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 主要仪器和设备
• 3.2.5 菌体培养及胞外锰过氧化物酶的获得
• 3.2.6 发酵菌体量测定方法
• 3.2.7 锰过氧化物酶活的测定
• 3.2.8 发酵液蛋白含量的测定
• 3.2.9 数据分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 菌体生长及产酶曲线
• 3.3.2 发酵培养基中碳源对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 3.3.3 发酵培养基中豆粕浓度对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 3.3.4 发酵培养基中氮源对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 3.3.5 发酵培养基中蛋白胨浓度对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 2+对 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产 MnP 的影响'> 3.3.6 Mn²⁺对 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产 MnP 的影响
• 3.3.7 表面活性剂对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 3.3.8 Tween-20 浓度对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 3.3.9 培养基初始pH 值对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产MnP 的影响
• 3.3.10 正交实验
• 3.3.11 培养基优化后Rhizoctonia sp. SYBC-M3 产酶曲线
• 3.4 讨论
• 第四章 Rhizoctonia sp. SYBC-M3锰过氧化物酶的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 主要仪器和设备
• 4.2.4 盐析范围的确定
• 4.2.5 锰过氧化物酶活的测定
• 4.2.6 发酵液蛋白含量的测定
• 4.2.7 数据分析
• 4.2.8 锰过氧化物酶同工酶的测定
• 4.2.9 SDS-PAGE 电泳
• 4.3 结果
• 4.3.1 硫酸铵沉淀
• 4.3.2 锰过氧化物酶的纯化
• 4.4 讨论
• 第五章 Rhizoctonia sp. SYBC-M3锰过氧化物酶的酶学性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 主要仪器和设备
• 5.2.4 锰过氧化物酶活及蛋白含量的测定
• 5.2.5 数据分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 温度对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶纯酶活性的影响
• 5.3.2 温度对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶纯酶稳定性的影响
• 5.3.3 pH 对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶纯酶活性的影响
• 5.3.4 pH 对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶纯酶稳定性的影响
• 5.3.5 金属离子对Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶纯酶酶活的影响
• 5.3.6 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶的酶学动力学
• 5.3.7 Rhizoctonia sp. SYBC-M3 锰过氧化物酶对不同底物的酶活
• 5.4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文