碱性成纤维生长因子鼻腔喷雾剂的研制及脑内递药特性研究

论文摘要

碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）是一种含154个氨基酸的阳离子多肽,分子量为16～18.5KD。 bFGF主要与两类受体作用,包括高亲和力的酪氨酸激酶受体（FGFRs）和低亲和力的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体（HSPG）。作为神经营养因子家族重要的一员,bFGF从以下几方面减弱阿尔茨海默症（Alzheimer disease, AD）的病理进程：与p淀粉样蛋白（β-amyloid, Ap）竞争HSPG上相同的结合位点,减弱神经毒性作用的信号转导；阻断因早老素基因突变而启动的神经退化级联反应；减少载脂蛋白E的分泌；抑制神经细胞凋亡等。但是目前关于bFGF治疗AD的研究主要集中于脑室给药,这种给药方法技术复杂、患者顺应性差。因此,寻找一条非侵入性、安全有效、患者顺应性好的给药途径对治疗AD这种慢性疾病具有重大的临床意义。鼻腔给药是近年来研究较多的给药途径之一,鼻—脑通路的存在为多肽蛋白类药物入脑提供了可能。但多肽蛋白药物透黏膜能力差,易被酶降解,且易被鼻纤毛清除,因此经鼻腔直接转运到脑内的药量很低,无法达到有效的治疗效果。本课题拟制备bFGF的鼻腔喷雾剂,通过在处方中加入吸收促进剂、稳定剂、生物粘附剂等辅料,以提高bFGF经鼻入脑的药量,为bFGF的临床应用及AD的防治提供实验资料,为其它多肽蛋白药物的脑内递送提供理论参考。本文第一部分建立了Calu-3细胞模型,Calu-3细胞经过11～14天的培养后,细胞形成了紧密的单层结构,可以用于药物转运和细胞毒性实验。通过细胞实验和在体实验筛选出最佳的吸收促进剂—0.5%壳聚糖,其能显著增加bFGF的累积转运量,且无细胞毒性、纤毛毒性,并且对细胞间紧密连接的作用可逆。肝素钠能显著抑制bFGF在兔鼻粘膜组织匀浆中的降解,是最佳的稳定剂。4%的甘露醇可调节药液至等渗,在此基础上确定了bFGF鼻腔喷雾剂的处方。本文第二部分对bFGF鼻腔喷雾剂进行了质量评价,结果制剂的pH为6.31+0.07,渗透压为313.3±5.0mOsm,黏度为127±3mPas,含量、生物学活性、每瓶总喷次、平均每喷主药含量、装量等指标均符合规定。鼻喷剂对黏膜纤毛运动影响小,持续给药7天后,大鼠鼻纤毛较浓密整齐,基本未见脱落,粘膜面完整,结构清楚,嗅粘膜厚度未发生变化。鼻喷剂的稳定性受高温影响大,制剂应在4℃、避光保存。加速实验和6个月的长期实验结果显示,鼻喷剂的各项指标均符合规定。本文第三部分对bFGF鼻喷剂的药动学及脑内递药特性进行研究。结果显示bFGF溶液剂与bFGF鼻喷剂鼻腔给药的绝对生物利用度分别为5.35%和7.53%,bFGF鼻喷剂的相对生物利用度是141%。制成鼻喷剂后提高了bFGF经鼻入脑的量,其在嗅球、大脑、小脑、海马中的AUC0-12h分别为bFGF溶液的1.11、1.95、1.40和1.93倍；与静脉给药相比脑中检测到完整药物的持续时间显著延长,且在各个脑组织的脑靶向指数均大于16,说明bFGF喷雾剂鼻腔给药后部分药物能直接转运入脑。本文第四部分采用Aβ25-35及鹅膏蕈氨酸双侧海马区注射构建大鼠AD模型,通过Morris水迷宫实验评价鼻腔给予bFGF溶液剂、bFGF鼻喷剂及静脉注射bFGF溶液剂对大鼠空间记忆障碍的改善作用。结果显示bFGF溶液低剂量鼻腔给药及bFGF溶液高剂量静脉给药后对减小大鼠寻台潜伏期效果不显著；bFGF溶液高剂量鼻腔给药能有效改善AD大鼠的空间记忆能力,大鼠上台的潜伏期随着训练天数的延长而缩短；bFGF鼻腔喷雾剂高、低剂量均对大鼠认知有明显改善作用,且能使AD模型大鼠海马乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰化酶活力恢复至假手术水平,表明其对中枢胆碱能系统具有一定的保护作用,同时鼻腔喷雾剂能有效减少模型大鼠海马区的神经元缺失、防止Aβ斑块沉积,发挥神经保护作用。上述结果显示bFGF鼻喷剂是一个有潜力的治疗AD的新制剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 本课题研究的设计
• 实验研究的技术关键及难点
• 参考文献
• 第一部分 bFGF鼻腔喷雾剂的处方筛选
• 第一节 Calu-3细胞模型的建立
• 1 仪器和材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料和试剂
• 1.3 HBSS/HEPES溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养条件
• 2.2 细胞的冻存
• 2.3 细胞的复苏
• 2.4 细胞的传代
• 2.5 细胞单分子层模型的建立及验证
• 3 实验结果
• 3.1 光学显微镜观察、酸性蛋白染色及细胞骨架染色
• 3.2 电镜观察细胞单层分子形态
• 3.3 TEER值的测定
• 3.4 荧光素钠的转运
• 4 讨论
• 第二节 bFGF鼻腔喷雾剂处方筛选
• 1 仪器和材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料和试剂
• 1.3 动物
• 1.4 溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 bFGF分析方法的建立
• 2.2 毒性的考察
• 2.3 吸收促进剂对药物转运的影响实验
• 2.4 大鼠鼻腔灌流模型筛选吸收促进剂
• 2.5 稳定剂对bFGF在家兔鼻黏膜组织匀浆液中降解的抑制作用
• 2.6 渗透压调节剂浓度的确定
• 2.7 数据处理
• 3 实验结果
• 3.1 bFGF分析方法的建立及评价
• 3.2 吸收促进剂的筛选
• 3.3 稳定剂的筛选
• 3.4 bFGF鼻腔喷雾剂的处方确定
• 4 讨论
• 4.1 ELISA分析方法测定bFGF
• 4.2 Calu-3细胞模型评价吸收促进剂的细胞毒性
• 4.3 细胞毒性和纤毛毒性的结果为何有较大差异?
• 4.4 壳聚糖浓度的选择及促吸收的机理
• 4.5 大鼠在体灌流模型
• 4.6 为何癸酸钠、DM-β-CD和聚-L-精氨酸这3种吸收促进剂促吸收效果不佳?
• 4.7 鼻腔喷雾剂的处方
• 5 小结
• 参考文献
• 第二部分 bFGF鼻腔喷雾剂的质量评价及初步稳定性试验
• 1 仪器和材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料和试剂
• 1.3 动物
• 2 实验方法
• 2.1 bFGF鼻腔喷雾剂的制备
• 2.2 bFGF鼻腔喷雾剂的质量评价
• 2.3 鼻粘膜毒性考察
• 2.4 初步稳定性试验
• 3 实验结果
• 3.1 bFGF鼻腔喷雾剂的质量评价
• 3.2 bFGF鼻腔喷雾剂的鼻粘膜毒性评价
• 3.3 初步稳定性试验
• 4 讨论
• 4.1 鼻粘膜毒性的考察
• 4.2 初步稳定性试验
• 5 小结
• 参考文献
• 第三部分 bFGF鼻腔喷雾剂的药动学及脑内递药特性研究
• 1 仪器和材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料和试剂
• 1.3 实验动物
• 1.4 溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 药动学研究
• 2.2 脑内递药特性研究
• 3 实验结果
• 3.1 药动学实验结果
• 3.2 bFGF脑组织分析方法的建立及评价
• 3.3 bFGF制剂在大鼠血和各个脑组织中的分布
• 4 讨论
• 4.1 药物经鼻给药后的两种入脑途径及bFGF脑内递药特性的分析
• 4.2 bFGF鼻腔喷雾剂与溶液剂相比为何生物利用度增加倍数不明显?
• 4.3 bFGF鼻腔喷雾剂与溶液剂相比的优势
• 4.4 放射性标记法与ELISA法测定结果的比较
• 5 小结
• 参考文献
• 第四部分 bFGF鼻腔喷雾剂的药效学研究
• 1 仪器和材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料和试剂
• 1.3 实验动物
• 1.4 溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 AD动物模型的建立
• 2.2 实验分组与治疗方案
• 2.3 大鼠Morris水迷宫试验
• 2.4 生化指标的测定
• 2.5 海马区形态学观察（苏木素—伊红染色）
• 2.6 Aβ斑块染色（刚果红染色）
• 2.7 统计分析
• 3 实验结果
• 3.1 定位航行试验
• 3.2 探索实验
• 3.3 生化指标的测定结果
• 3.4 海马区形态学观察
• 3.5 Aβ斑块染色
• 4 讨论
• 4.1 几种药效学评价指标的意义
• 4.2 药效学与药动学结果的相关性
• 5 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 在校期间发表论文
• 致谢