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表观遗传试剂应用于截短侧耳素产生菌Pleurotus mutilus-04的初步研究

2020-12-26阅读(1031)

表观遗传试剂应用于截短侧耳素产生菌Pleurotus mutilus-04的初步研究

论文摘要

背景：随着近些年来抗生素的过度使用,产生了很多耐药菌,使人类对众多常见疾病束手无策,因此寻找新型化合物促进药物开发迫在眉睫。采用小分子酶抑制剂修饰真菌染色体的方法提供了一个快速有效的在其自身细胞内挖掘真菌天然产物的方法,该方法不需要昂贵的仪器设备,可以广泛的在许多实验室中应用,成本较低,不需要较大工作量且对真菌的遗传背景无过高要求。随着近些年来表观遗传学研究的深入,真菌的表观遗传修饰研究逐渐成为热点。表观遗传学就是指在染色体中DNA序列不发生变化的情况下,基因表达却发生了可遗传的改变,其分子机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及RNA干扰等几个方面,在真菌中研究比较多的就是DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化。目前,真菌的表观遗传研究手段主要是过表达或缺失相关表观修饰基因或利用小分子表观遗传试剂两个方面。真菌进行表观遗传修饰可能会改变真菌的次级代谢产物谱,不仅可以提高多种已知次级代谢产物的产量,而且可以激活沉默生物合成基因簇产生新的代谢产物。目的：本实验主要通过两种小分子表观遗传试剂伏立诺他（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）—组蛋白去乙酰化试剂和5-杂氮胞苷—DNA甲基转移酶抑制剂来对一株能够产生截短侧耳素的大型担子纲真菌Pleurotus mutilus-04进行菌种改良。观察小分子表观遗传试剂作用P utilus-04后,其菌落、菌丝形态的变化以及其次级代谢产物谱的变化。方法：本实验通过96孔板方法测定两种表观遗传试剂的MIC值。P.mutilus-04接种一天后加入2倍MIC表观遗传试剂,发酵培养7天后,使用显微镜对其菌丝进行观察,采用高效液相色谱对其次级代谢产物进行分析,并使用制备型高效液相色谱对化合物进行分离,最后利用核磁共振仪及质谱仪对化合物进行结构解析。结果：研究发现伏立诺他作用P.mutilus-04后,胞内发现了化合物A,进行了紫外波普扫描以及质谱分析,确定其为新化合物A；在其发酵液中分离得到了伏立诺他的结构类似物-化合物D,活性检测发现化合物D的抗癌活性明显低于伏立诺他。伏立诺他实验组菌体中截短侧耳素的产量相对于阴性对照组中截短侧耳素的产量下降了六倍,而5-杂氮胞苷实验组中截短侧耳素的产量相对于阴性对照组中截短侧耳素的产量没有较大变化。虽然5-杂氮胞苷对P.mutilus-04的次级代谢产物没有明显的影响,但其对P.mutilus-04的菌落形态有较明显的影响,经5-杂氮胞苷处理后的P.mutilus-04,菌落半径较大,菌丝稀疏。结论：伏立诺他和5-杂氮胞苷两种表观遗传试剂对大型担子纲真菌P.mutilus-04的菌落、菌丝形态,次级代谢产物等方面有不同程度的影响,证明这种快捷简便的方法不仅可以在青霉曲霉中,也可以在大型担子纲真菌中进行菌种改良,验证了这种方法的应用广泛性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 综述
  • 1.1 表观遗传调控
  • 1.1.1 DNA甲基化
  • 1.1.2 组蛋白修饰
  • 1.2 表观遗传修饰与次级代谢产物生物合成
  • 1.2.1 组蛋白去乙酰化与次级代谢产物生物合成
  • 1.2.2 组蛋白甲基化与次级代谢产物生物合成
  • 1.2.3 组蛋白sumo化与次级代谢产物生物合成
  • 1.3.化学表观遗传学在丝状真菌次级代谢产物研究中的应用
  • 1.3.1 DNA甲基转移酶抑制剂对次级代谢生物合成的影响
  • 1.3.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对次级代谢生物合成的影响
  • 1.4 截短侧耳素产生菌的表观遗传调控研究
  • 第2章 绪论
  • 第3章 实验材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 菌株
  • 3.1.2 培养基
  • 3.1.3 主要试剂
  • 3.1.4 主要仪器
  • 3.2 表观遗传试剂对P.mutilus-04的选育
  • 3.2.1 菌丝悬液的制备
  • 3.2.2 菌丝计数
  • 3.2.3 表观遗传试剂最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）测定
  • 3.3 检测表观遗传试剂对P.mutilus-04形态的影响
  • 3.3.1 对菌落形态及固体培养基中菌丝形态的影响的检测
  • 3.3.2 在发酵液中对菌丝形态影响的检测
  • 3.4 菌种发酵及发酵产物的HPLC检测
  • 3.4.1 菌种发酵
  • 3.4.2 提取
  • 3.4.3 发酵产物的HPLC检测
  • 3.4.3.1 胞内产物检测
  • 3.4.3.2 SAHA实验组胞外产物检测
  • 3.4.3.3 5-杂氮胞苷胞外产物检测
  • 3.4.4 截短侧耳素的HPLC检测
  • 3.5 目标产物的分离纯化及结构鉴定
  • 3.5.1 目标产物的分离纯化
  • 3.5.2 目标产物的结构鉴定
  • 3.6 目标产物的活性检测
  • 3.6.1 抗菌活性的检测
  • 3.6.2 抗癌活性的检测
  • 第4章 实验结果与分析
  • 4.1 SAHA和5-杂氮胞苷对P.mutilus-04的MIC测定结果
  • 4.2 表观遗传试剂对P.mutilus-04形态的影响
  • 4.2.1 对单菌落形态的影响
  • 4.2.2 对培养皿中菌丝的形态影响
  • 4.2.3 发酵液中菌丝形态
  • 4.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA实验组发酵产物的HPLC检测
  • 4.3.1 胞内代谢产物检测结果
  • 4.3.2 胞外代谢产物检测结果
  • 4.3.3 对截短侧耳素产量的影响
  • 4.4 DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮胞苷实验组发酵产物的HPLC检测
  • 4.4.1 胞内代谢产物检测结果
  • 4.4.2 胞外代谢产物检测结果
  • 4.4.3 对截短侧耳素产量的影响
  • 4.5 目标产物的分离纯化及结构鉴定
  • 4.5.1 SAHA实验组中P.mutilus-04胞内新产生的化合物A的分离纯化
  • 4.5.2 SAHA实验组中P.mutilus-04发酵液中新产生的化合物B、C、D的分离纯化
  • 4.5.3 SAHA实验组中P.mutilus-04发酵液中化合物D的结构鉴定
  • 4.6 化合物D的活性检测
  • 4.6.1 抗菌活性检测
  • 4.6.2 抗癌活性检测
  • 第5章 讨论
  • 5.1 表观遗传试剂作用于P.mutilus-04的MIC值的确定
  • 5.2 表观遗传试剂对P.mutilus-04形态的影响
  • 5.3 SAHA对P.mutilus-04胞内次级代谢产物的影响
  • 5.4 从P.mutilus-04发酵液中提取到的SAHA的结构衍生物
  • 5.5 5-杂氮胞苷对P.mutilus-04次级代谢产物的影响
  • 5.6 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

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