论文摘要
本论文对检测动物源性食品中四环素残留的间接竞争酶联免疫检测方法进行了系统的研究。采用甲醛法将四环素与钥孔血蓝蛋白偶联制备人工免疫原。通过免疫新西兰大白兔得到抗血清,使用Protein A Sepharose-4B亲和层析法纯化血清得到高效价和高特异性的抗四环素多克隆抗体。采用甲醛法将四环素与卵血清白蛋白连接制备包被原,建立了间接竞争酶联免疫检测方法,对影响实验的各因素（包被量,抗体稀释度,抗体稀释液等）进行了优化与研究,最终确定包被量为0.05¨μgg/孔,抗体稀释度为1：10000,抗体稀释液为0.1%BSA/PBS,封闭液为0.5%乳粉/PBS溶液时所获得的标准曲线灵敏度最高,稳定性最好。本实验所建立方法的灵敏度（IC50）为0.33±0.09μg/L,最低检出限（IC15）为0.01±0.0041μg/L。本实验所制备的抗体具有良好的特异性,与两种结构类似物土霉素、金霉素交叉反应率分别为0.39%和4.42%,与其他常用兽药青霉素、链霉素、氯霉素均无交叉反应。选择牛奶、蜂蜜、猪肉、牛肉、鸡肉、鱿鱼、大眼鲷鱼、比目鱼、虾作为样品进行添加回收实验,牛奶添加回收率为85.88%-109.17%,蜂蜜添加回收率为94.52%-107.59%,猪肉添加回收率为84.19%-98.96%,牛肉添加回收率为75.91%-105.58%,鸡肉添加回收率为84.40%-109.64%,鱿鱼添加回收率为73.08%-115.44%,大眼鲷鱼添加回收率为67.45%-104.76%,比目鱼添加回收率为74.55%-112.46%,虾添加回收率为82.84%-111.85%。本实验所建立的方法在牛奶、鱿鱼中检出限为5μg/kg,蜂蜜、猪肉、牛肉、鸡肉、大眼鲷鱼、比目鱼、虾检出限为10μg/kg,板内变异和板间变异均小于20%。使用国外试剂盒验证本实验建立的四环素间接竞争酶联免疫法,两种方法的检测结果一致性很高,其线性回归方程为：y=0.8542x+2.2848,线性相关系数R2=0.9954。说明本研究建立的方法具有很好的准确性和精密度。本研究所建立的四环素间接竞争酶联免疫检测方法灵敏度高、特异性好、准确性高、样品前处理简单,适合于动物源性食品中四环素残留的快速检测。
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摘要ABSTRACT1 前言1.1 食品安全现状1.2 兽药残留概述1.2.1 兽药残留产生的原因1.2.2 兽药残留的危害1.2.3 兽药残留的控制措施1.3 免疫分析研究概述1.3.1 同位素免疫分析方法1.3.2 非同位素免疫分析方法1.3.3 ELISA的应用1.4 四环素概述1.4.1 四环素的理化性质1.4.2 四环素的药物毒理学作用与危害1.4.3 四环素残留现状及管理1.4.4 四环素残留的检测方法1.5 论文研究的目的及意义1.6 研究内容2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验药品2.1.2 实验试剂2.1.3 仪器及设备2.1.4 基质样品2.1.5 常用溶液的配制2.2 实验方法2.2.1 四环素免疫原的制备2.2.2 四环素包被原的制备2.2.3 四环素多克隆抗体制备2.2.4 四环素间接竞争ELISA检测方法的建立2.2.5 四环素抗体特异性的测定2.2.6 样品前处理2.2.7 样品的添加回收2.2.8 四环素间接竞争ELISA检测方法性能指标的评价2.2.9 商品化试剂盒验证3 结果与讨论3.1 四环素人工抗原的制备与鉴定3.1.1 甲醛一步连接法3.1.2 戊二醛一步连接法3.1.3 重氮法3.2 四环素抗体的制备3.2.1 抗血清效价与特异性的测定3.2.2 抗体的纯化3.3 四环素间接竞争ELISA检测方法的建立3.3.1 包被原的筛选3.3.2 包被量和抗体稀释度的优化3.3.3 抗体稀释缓冲溶液的筛选3.3.4 封闭液的筛选3.3.5 HRP标记羊抗兔二抗稀释度的优化3.3.6 四环素间接竞争ELISA检测方法标准曲线的绘制3.4 四环素抗体的特异性3.5 样品添加回收实验3.5.1 牛奶样品的添加回收3.5.2 蜂蜜样品的添加回收3.5.3 猪肉样品的添加回收3.5.4 牛肉样品的添加回收3.5.5 鸡肉样品的添加回收3.5.6 鱿鱼样品的添加回收3.5.7 大眼鲷鱼样品的添加回收3.5.8 比目鱼样品的添加回收3.5.9 虾样品的添加回收3.6 四环素间接竞争ELISA检测方法性能指标的评价3.6.1 检测限3.6.2 精密度3.6.3 温度对抗体稳定性的影响3.7 商品化试剂盒验证4 结论5 展望6 参考文献7 攻读硕士学位期间发表论文情况8 致谢
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标签：四环素论文; 残留论文; 酶联免疫法论文; 动物源性食品论文;
