论文摘要
背景和目的:机体的免疫反应在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）致病和H.pylori疫苗的免疫保护中均起重要作用,因此,阐明H.pylori感染的免疫致病机制和H.pylori疫苗的免疫保护机制,对于H.pylori相关性疾病的防治具有十分重要的意义。T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子（T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule,Tim）是一新近发现的T细胞表面的跨膜蛋白家族,它对CD4+T细胞分化成Th1和Th2细胞,调控效应T细胞（Th1和Th2）的应答起着重要作用。Tim-3是Tim家族中的重要成员,它表达在分化成熟的Th1细胞,调节不同CD4+T细胞亚群的功能,并影响Toll样受体（Toll like receptor, TLR）信号通路和调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）的功能。但Tim-3在H. pylori感染免疫致病和H. pylori疫苗免疫保护中是否起作用,目前尚不清楚。为此,本文研究了Tim-3阻断对H. pylori感染和不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内H. pylori定植、炎症反应、TLR信号通路和Treg的影响,从一新的角度探讨H. pylori致病机制和疫苗的免疫保护机制。方法:1.H. pylori全菌蛋白抗原壳聚糖微球的制备及体外释放特性研究采用Berthold沉淀法制备壳聚糖微球,并根据不同的壳聚糖、不同的沉淀剂、不同冰乙酸浓度、不同pH值和是否进行超声处理来优化壳聚糖微球制备条件;使用扫描电镜及粒径分析仪观察壳聚糖微球的形态及粒径分布;以不同量比的微球与抗原,进行壳聚糖微球包裹H. pylori全菌蛋白抗原;采用BCA蛋白定量法测量分析微球的抗原包裹率、包裹量及释放率。2. Tim-3阻断对H. pylori感染免疫致病和疫苗免疫保护作用影响及机制的研究（1）Tim-3阻断对H. pylori疫苗免疫保护作用影响及机制的研究:68周龄的SPF级BALB/C小鼠随机分为以下5组:①正常对照组:PBS溶液;②H. pylori抗原+CT;③抗Tim-3单抗预处理+H. pylori抗原+CT;④壳聚糖微球-H. pylori抗原;⑤抗Tim-3单抗预处理+壳聚糖微球-H. pylori抗原;各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,免疫后4周后4组小鼠给予1×109活菌/ml的SS1 H. pylori菌液0.5ml/只进行攻击,隔日一次,共4次。未次攻击后4周,处死小鼠,取标本待测。（2）Tim-3阻断对H. pylori感染免疫致病作用影响及机制的研究:68周龄的SPF级BALB/C小鼠随机分为以下2组:①直接建立H. pylori感染模型;②Tim-3单抗预处理后建立H. pylori感染模型。模型的建立:给予含109/ml的SS1 H. pylori菌液,0.5ml/只灌胃,隔日1次,共5次。末次灌胃12周后,处死小鼠,取标本待测。（3）各项指标检测:①胃黏膜内H. pylori的检测:采用改良Giemsa染色检测;②胃黏膜炎症程度检测:采用HE染色,并按Sakagami法评分;③胃黏膜内TLR4、MyD88、NF-κB p65、Foxp3蛋白检测:采用免疫组织化学染色法检测;④胃黏膜内TLR4和MyD88 mRNA检测:采用RT-PCR方法检测;⑤血清抗H. pylori IgG含量的检测:采用间接ELISA法检测。结果:1. H. pylori全菌蛋白抗原壳聚糖微球的制备及体外释放特性研究从32种壳聚糖微球制备方案中筛选出了以海得贝壳聚糖为原料、冰乙酸的浓度为1%、硫酸钠为沉淀剂、pH值为5.0、不进行超声处理的最佳制备方案;经扫描电镜（SEM）示微球光滑圆整、致密,粒径分布在1.0-5.0μm;抗原与微球的量比为1:5时包裹率最大,包裹时间为3h时包裹率可达最大,抗原包裹率为79.92%,包裹量为16.47%;体外释放实验表明,总抗原释放率为20.39%,呈缓慢释放状态。2. Tim-3阻断对H. pylori感染免疫致病和疫苗免疫保护作用影响及机制的研究（1）两种佐剂的H. pylori疫苗组预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内H. pylori定植密度均低于未阻断小鼠（P<0.05）,与正常对照组无差别（P>0.05）;不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠的H. pylori定植密度无差别（P>0.05）。（2）H. pylori活菌接种后胃黏膜内H. pylori定植密度显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断对H. pylori定植密度无影响（P>0.05）。（3）两种佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃粘膜炎症程度均高于正常对照组（P<0.05,0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜炎症程度均高于未阻断小鼠（P<0.05,0.01）,不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜炎症程度无差别（P>0.05）。（4）H.pylori活菌接种后胃黏膜炎症程度显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜炎症程度显著高于未阻断小鼠（P<0.05）。（5）两种佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内TLR4 mRNA的表达和TLR4阳性细胞积分均显著高于正常对照组（P<0.05,0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内TLR4阳性细胞积分均显著高于未阻断小鼠（P<0.05,0.01,0.001）,在以壳聚糖微球为佐剂的H. pylori疫苗组TLR4 mRNA的表达在Tim-3单抗阻断组显著高于未阻断组（P<0.001）,而在以CT为佐剂小鼠Tim-3单抗阻断组虽高于未阻断组,但无统计学差别（P>0.05）。不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内TLR4阳性细胞积分无差别（P>0.05）,TLR4 mRNA表达在无Tim-3单抗阻断小鼠,在以CT为佐剂组显著高于以壳聚糖微球为佐剂组（P<0.05）,但在Tim-3单抗阻断小鼠二组之间无差别（P>0.05）。（6）H. pylori活菌接种后胃黏膜内TLR4 mRNA的表达和TLR4阳性细胞积分均显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜TLR4 mRNA的表达和TLR4阳性细胞积分显著高于未阻断小鼠（P<0.05,0.001）。（7）两种佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内MyD88 mRNA的表达和MyD88阳性细胞积分均显著高于正常对照组（P<0.05,0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内MyD88 mRNA的表达和MyD88阳性细胞积分均显著高于未阻断小鼠（P<0.05,0.001）。不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内MyD88阳性细胞积分无差别（P>0.05）,MyD88 mRNA表达在无Tim-3单抗阻断小鼠,在以CT为佐剂组显著高于以壳聚糖微球为佐剂组（P<0.05）,但在Tim-3单抗阻断小鼠二组之间无差别（P>0.05）。（8）H. pylori活菌接种后胃黏膜内MyD88 mRNA的表达和MyD88阳性细胞积分均显著高于正常对照组（P<0.001,0.01）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜MyD88 mRNA的表达和MyD88阳性细胞积分显著高于未阻断小鼠（P<0.01,0.001）。（9）两种佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比均显著高于正常对照组（P<0.05,0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比显著低于未阻断小鼠（P<0.001）。不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比无差别（P>0.05）。（10）H. pylori活菌接种后胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比显著低于未阻断小鼠（P<0.001）。（11）两种佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内NF-κBp65阳性细胞积分均显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内NF-κBp65阳性细胞积分高于未阻断小鼠（P<0.01）。不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内NF-κBp65阳性细胞积分无差别（P>0.05）。（12）H. pylori活菌接种后胃黏膜内NF-κBp65阳性细胞积分均显著高于正常对照组（P<0.001,0.01）,预先给予Tim-3单抗阻断小鼠胃黏膜内NF-κBp65阳性细胞积分高于未阻断小鼠（P<0.001）。（13）两种佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠血清抗H. pylori IgG含量均显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断对小鼠血清抗H. pylori IgG含量无影响（P>0.05）。进一步分析不同佐剂的H. pylori疫苗接种小鼠血清抗H. pyloriIgG含量无差别（P>0.05）。（14） H. pylori活菌接种小鼠血清抗H. pylori IgG含量均显著高于正常对照组（P<0.001）,预先给予Tim-3单抗阻断对小鼠血清抗H. pylori IgG含量无影响（P>0.05）。进一步分析H. pylori疫苗接种小鼠血清抗H. pylori IgG含量均显著高于H. pylori感染小鼠（P<0.05）。结论:1.本研究筛选的壳聚糖微球制备条件所制备的壳聚糖微球对H. pylori全菌蛋白抗原具有较高的包裹率和较好的控释效果。2. Tim-3阻断可提高H. pylori疫苗的免疫保护率,但并不降低H. pylori自然感染小鼠胃黏膜内H. pylori定植密度。3. Tim-3阻断可加剧H. pylori疫苗接种小鼠和H. pylori感染小鼠胃黏膜炎症程度。4. Tim-3阻断可上调TLR4、MyD88的表达和促进NF-κB活化,降低CD4+CD25+Foxp3+Treg的数量,这可能是它增强H .pylori疫苗的免疫保护作用的机制,但并不影响H. pylori自然感染小鼠胃黏膜内H. pylori定植密度。5.以壳聚糖微球为佐剂的H. pylori疫苗与传统的佐剂CT为佐剂的H. pylori疫苗对H. pylori感染具有同样的免疫保护作用。
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