论文摘要
本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体rgs1-2、gpa1-4、aba3和abi1、过表达35S:RGS1为材料,通过转基因细胞系构建、差异显示分析和双突变体构建分析等技术,用分子生物学、生物化学、分子遗传学等方法研究了AtRGS1蛋白在拟南芥葡萄糖信号转导途径中的作用。取得了以下主要研究结果:1、建立了拟南芥悬浮培养细胞体系,并对AtRGS1蛋白及相关结构域进行了细胞定位根据AtRGS1蛋白的特有结构,将编码AtRGS1的两个结构域分别进行克隆表达,结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术证明:AtRGS1蛋白定位于细胞膜,AtRGS1-N端结构域和AtRGS1-C端结构域分别定位于质膜和细胞核。D-葡萄糖和ABA处理可以改变AtRGS1全蛋白的亚细胞定位,而AtRGS1-N端结构域定位未发生改变。2、筛选了AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因以拟南芥野生型Col-0和突变体rgs1-2为材料,运用差异显示技术筛选AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因。经反向Northern验证,得到四个差异表达蛋白,分别是拟南芥UDP葡萄糖苷转移酶（UGTs）、拟南芥γ谷氨酰水解酶、拟南芥苏氨酸内切酶、拟南芥ADP-核糖基化因子（ARF）。它们很可能是AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中重要的作用因子。其中ADP-核糖基化因子（ARF）可能和AtRGS1-C端结构域具有相互作用,参与了AtRGS1-C端结构域的迁移,而且可能将处于游离状态的AtRGS1的C端结构域通过胞内运输转运至细胞膜,使其和跨膜结构域重新融合。UDP葡萄糖苷转移酶（UGTs）是催化拟南芥内源脱落酸（ABA）糖基化的一种酶,在外源高浓度葡萄糖处理后,其表达量降低,这就表明,外源高浓度葡萄糖处理导致内源ABA分解的速度降低,从而促进ABA抑制的种子萌发。而且,UDP葡萄糖苷转移酶很可能是AtRGS1介导的葡萄糖信号转导途径中下游的效应分子。3、明确了拟南芥种子萌发对葡萄糖信号响应过程中AtRGS1的作用及其与ABA的关系（1）以拟南芥野生型Col-0为遗传背景的突变体为材料,研究了AtRGS1蛋白在葡萄糖介导的种子萌发过程中的作用。结果显示,与Col相比,AtRGS1过表达的35S:RGS1和Gα缺失突变体gpa1-4的种子萌发对D-葡萄糖的抑制作用表现为超敏感,而AtRGS1缺失突变体rgs1-2表现为低敏感。35S:RGS1、rgs1-2和Col-0种子萌发对葡萄糖类似物甘露糖的响应无明显差异。己糖激酶抑制剂NAG处理对葡萄糖抑制种子萌发的效应不明显,但显著降低了甘露糖对种子萌发的抑制作用。表明在种子萌发过程中,AtRGS1参与的葡萄糖信号转导途径是一特殊途径,且该途径不依赖于己糖激酶。（2）以AtRGS1缺失突变体rgs1-2、ABA合成突变体aba3、ABA响应不敏感突变体abi1和双突变体aba3rgs1-2、abi1rgs1-2,以及野生型Col-0为材料,研究了葡萄糖介导的拟南芥种子萌发过程中AtRGS1与ABA3和ABI1的相互关系。结果表明:双突变体aba3rgs1-2表现出比单突变体对高浓度葡萄糖的抑制作用更加不敏感。说明AtRGS1和ABA3都参与了拟南芥种子萌发过程的葡萄糖信号的转导。双突变体abi1rgs1-2表现出和单突变体rgs1-2相似的对高浓度葡萄糖的抑制作用不敏感,而单突变体abi1和野生型Col均表现为敏感。