论文摘要
[目的]体外分离并富集人胶质母细胞瘤干细胞（Glioblastoma stem cells, GSCs）,观察其生物学特征,包括形态学、自我更新能力、多向分化潜能以及在NOD-SCID小鼠脑内形成具有原发肿瘤相似表型的异种移植肿瘤的能力。比较不同基因分型GSCs向血管内皮细胞转分化的潜能。观察并描述体外人基质细胞型GSCs转分化为血管内皮细胞,包括在内皮细胞转分化培养基中诱导培养后,形成管样结构并表达多个血管内皮细胞标记物。初步探讨人基质细胞型GSCs转分化为血管内皮细胞的相关机制。分析HIF2α和Twsit1在人基质细胞型GSCs向血管内皮细胞转分化过程中的作用。[方法]人胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）手术标本的获取均经过患者书面知情同意,并得到复旦大学附属华山医院伦理委员会批准。在无血清培养基（含EGF、bFGF、N2添加剂）中培养人GBM来源细胞。采用神经球克隆形成实验、免疫荧光技术及Western-blot等方法分别评估肿瘤干细胞的增殖、多向分化分化潜能及其干细胞标记物的表达。采用流式细胞技术从人GBM来源的细胞中分选出CD133+和CD133-细胞。在无血清培养基中,比较CD133+和CD133-细胞的形态、克隆形成能力、侵袭和迁移能力以及多个干细胞标记物的表达。将GBM来源的细胞注射到NOD-SCID、鼠脑内,比较CD133+和CD133-细胞形成异种移植肿瘤的能力。采用HE染色及免疫组化技术分析CD133+GBM细胞异种移植肿瘤的病理特征及其表型。通过基因芯片分析,将17例人GBM样本分为经典型、前神经元型及基质细胞型。将不同基因分型人GSCs在内皮细胞培养基（DMEM/F-12培养基、添加10%胎牛血清、10ng/ml VEGF、10ng/ml N2supplement、10ng/ml EGF和5ng/ml bFGF）中诱导培养后,通过流式细胞技术比较其中血管内皮祖细胞（CD144+细胞）的比例。三维培养时,将100μl Matrigel加入到24孔板中,凝胶形成后将CD144+人基质细胞型GSCs悬液加入到培养板中。在倒置显微镜下定期观察细胞形态变化,通过免疫荧光、RT-PCR及Western-blot分析其中血管内皮细胞标记物的表达,包括VE-Cadherin, CD31,Flk-1和Tie-2。人GSCs分别在常氧（20%02）和缺氧（1%02）条件下培养。在低氧培养箱中诱导缺氧环境。Western-blot分析这两种情况下Twist1和HIF-2a蛋白的表达。使用HIF2α或Twist1特异性的小干扰RNA下调人基质细胞型GSCs中这两种蛋白的表达。通过管样形成实验及Western-blot技术来评估HIF2α和Twist1在人基质细胞型GSCs向血管内皮细胞转分化过程中的作用。[结果]人GBM来源的细胞在无血清培养基中能够增殖并形成肿瘤球。仅有少数（大约11.4%-18.6%）的人GBM来源细胞能够形成肿瘤球。有限稀释实验表明单个细胞所形成的肿瘤球中的部分细胞具有无限增殖能力。在整个培养过程中,形成肿瘤球的细胞比例保持稳定,表明人GSCs非对称分裂。免疫荧光结果表明人GSCs能够表达脑肿瘤干细胞标记物,如CD133和Nestiin。通过免疫荧光技术检测GFAP, βⅢ-tubulin和oligl的表达,结果表明人GSCs在有血清培养基中培养后,其更倾向分化为星形细胞,同时也能够多向分化为神经元和少突胶质细胞,这说明体外培养时GSCs具有多向分化潜能。CD133被成功的用于分离和富集人GSCs。分散的CD133+细胞能够在无血清培养基中形成肿瘤球并表达多个干细胞标记物,而CD133-细胞在无血清培养中多呈现贴壁培养而无法形成肿瘤球。CD133+细胞较CD133-细胞具有更强的迁移及侵袭能力。将相同数目的人GBM细胞注射到NOD-SCID小鼠脑内4周后,CD133+细胞能够形成异种移植肿瘤,而CD133-细胞则无法形成。CD133+细胞形成的异种移植肿瘤具有GBM典型的病理学特征,免疫组化结果表明CD133+细胞形成的异种移植肿瘤与病人原发肿瘤的表型相互匹配。人GSCs在内皮细胞分化培养基中诱导7天后,流式细胞分析结果表明在人基质细胞型GBM中血管内皮祖细胞（CD144+）的比例较另外两种亚型肿瘤显著升高。在Matrigel上培养时,CD144+人基质细胞型GSCs发生一系列的形态学变化：细胞之间形成稀疏连接、形成不连续的网状结构、形成连续的网状结构、形成绳索样结构并最终形成管样结构。透射电镜结果表明人基质细胞型GSCs在转分化后具有血管内皮细胞的超微结构。RT-PCR及、Vestern-blot结果表明转分化后CD144+人基质细胞型GSCs中血管内皮细胞标记物VE-Cadherin, CD31,Flk-1和Tie-2的转录和表达水平均显著升高。免疫荧光结果表明人基质细胞型GSCs表达EMT特征性标记物,如Vimentin、 Snail、Slug、Twist1和N-Cadherin。CD144+人基质细胞型GSCs中HIF2αt和Twist1的表达较CD144-细胞显著升高。低氧能够促进人基质细胞型GSCs形成毛细血管样结构。为了进一步验证管样形成实验的结果,我们使用Western-blot检测多个血管内皮细胞标记物的表达,结果表明低氧条件下包括CD31、Flk-1及VE-Cadherin在内的多个血管内皮细胞标记物的表达显著高于常氧。RT-PCR及Western-blot结果表明缺氧情况下HIF2a和Twist1的nRNA及蛋白水平的表达均显著升高。低氧情况下,人基质细胞型GSCs在内皮细胞培养基中诱导后,HIF2a siRNA能显著减少内皮细胞标记物以及Twist1的表达,并显著降低其在Matrigel上形成管样结构的能力。当Twist1被其特异性siRNA沉默后,血管内皮细胞标记物CD31、Flk-1及VE-Cadherin的蛋白表达水平显著下降,但HIF2a的表达水平无显著改变。管样形成实验结果表明,wistl siRNA能显著降低人基质细胞型GSCs形成管样结构的能力。[结论]人GBM来源的细胞在无血清培养基中能够增殖并形成肿瘤球。人GSCs在含血清培养基中能够多向分化。从人GBM中分离的CD133+细胞具有肿瘤干细胞特征。在NOD-SCID小鼠大脑中,CD133+人GSCs能够形成与病人原发肿瘤相似的异种移植肿瘤。人基质细胞型GSCs向内皮细胞转分化的能力较经典型及前神经元型更强。人基质细胞型GSCs在体外能够转分化为血管内皮细胞。低氧促进人基质细胞型GSCs向血管内皮细胞转分化。缺氧条件下,HIF-2a和Twistl信号通路在人基质细胞型GSCs向内皮细胞转分化过程中被激活。缺氧介导的人基质细胞型GSCs向血管内皮细胞转分化必需依赖HIF-2a及其下游基因Twistl信号转导通路的激活。