染矽尘大鼠支气管肺泡灌洗液细胞与蛋白成分分析

论文摘要

目的尘肺是我国目前最常见的危害较为严重的一种职业性肺部疾病,专家估计尘肺病实际发生的病例数不少于100万人,预计今后10年至15年我国尘肺病发病总数还将呈继续上升趋势。根据2005年尘肺病例数据分析表明,矽肺和煤工尘肺仍是最主要的尘肺病,两者共占尘肺病例总数的90.8%,其中矽肺病例占尘肺总病例约50%,是尘肺中危害最严重的职业病之一。目前比较公认的矽肺发病机制有矽尘毒性、脂质过氧化作用、肺内细胞机制、细胞因子网络等,但是尚未最终阐明,从而严重制约了矽肺病的临床早期诊断与治疗的发展。支气管肺泡灌洗术（BAL）用于肺部疾病的研究,已有近百年的历史。近30年来,由于纤维支气管镜的发明与引入,使BAL作为一种相对安全的技术手段,更被广泛用于科研和临床。支气管肺泡灌洗液（BALF）中的成分来源于气道及肺泡上皮表层,它能反映肺实质的病变过程。对其中有形成分和无形成分进行分析,探索哪些物质的改变在尘肺早期病变中起到了关键性作用,试图寻找矽肺早期诊断和肺纤维化进程评价的生物标志,为进一步揭示尘肺的发病机制提供参考。方法选用SPF级健康成年雄性SD大鼠40只体重（200±16）g,随机分成对照组和实验组;分别以0.9%的生理盐水lml、50mg/ml的SiO2混悬液lml气管内灌注,制备正常及染矽尘动物模型;两组大鼠40天后经股动脉放血处死,通过支气管肺泡灌洗术获取两组大鼠的BALF样品;对BALF中的细胞成分进行总数计数及分类计数;分别采用Bradford法、黄嘌呤氧物酶法、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、ELISA法对BALF中的总蛋白含量、SOD活力、微量元素（铁、锌、锰）、CC10的含量进行测定;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术初步分离BALF中可溶性蛋白成分;利用蛋白质组学的双向电泳技术,按200μg蛋白加样量将蛋白样品溶液与水化缓冲液混匀,总体积为340μl（IPG胶条18cm,pH3～10）,进行第一相等电聚焦,再以10%SDS-PAGE作第二相分离,分别对两组BALF中的蛋白质成分进行分离;同时对肺组织进行HE染色,普通光镜下观察肺组织的病理学改变。结果1染矽尘组大鼠BALF中细胞总数为（1.21±0.44）×107/ L、白细胞总数为（1.14±0.51）×106/ L、中性粒细胞总数为（0.53±0.08）×106/ L、巨噬细胞总数为（9.97±3.91）×106/ L、淋巴细胞总数为（0.94±0.42）×106/ L,正常组大鼠BALF中细胞总数为（6.30±2.19）×106/ L、白细胞总数为（0.52±0.21）×106/ L、中性粒细胞总数为（0.21±0.09）×106/ L、巨噬细胞总数为（5.04±1.52）×106/ L、淋巴细胞总数为（0.31±0.15）×106/ L。结果显示染矽尘组大鼠较正常组大鼠BALF中细胞总数及各类炎性细胞数均明显升高（P <0.05）;2染矽尘组大鼠BALF中总蛋白含量为1.06±0.56g/l、上清中SOD活力为14.24±8.01U/ml、细胞中SOD活力为22.01±6.46 U/mgprot,正常组大鼠BALF中总蛋白含量为0.62±0.27 g/l、上清中SOD活力为13.61±8.61U/ml、细胞中SOD活力为14.01±7.38 U/mgprot。结果显示染矽尘组大鼠BALF中总蛋白含量及细胞中SOD活力较正常组大鼠均明显升高（P <0.05）,而两组大鼠上清中SOD活力差别无统计学意义（P >0.05）;3染矽尘组大鼠BALF中铁、锌、锰元素含量分别为1.84±1.10μg/ml、6.03±2.54μg/ml、0.16±0.05μg/ml,正常组BALF中铁、锌、锰元素含量分别为4.76±1.70μg/ml、2.51±1.77μg/ml、0.09±0.04μg/ml。其中染矽尘组大鼠BALF中锌、锰元素的含量较正常组明显升高,而铁元素的含量则较正常组降低（P <0.05）;4染矽尘组大鼠BALF中CC10的含量（0.77±0.22g/l）较正常组大鼠降低（0.41±0.15g/l）（P <0.05）;5采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术获得了两组BALF较清晰的蛋白质条带,两组大鼠BALF中所分离出的蛋白质条带相比较发现无论是条带的数量还是条带的深浅程度均发生变化;6采用双向电泳技术分离蛋白质,获得了较清晰的正常及染矽尘大鼠BALF中蛋白质的双向电泳图谱。两组大鼠BALF的2-DE图谱进行比较,发现两组BALF中蛋白成分存在明显的差异,这些差异主要表现在电泳图谱中蛋白斑点的增减以及染色的深浅上。7常规病理切片显示正常组大鼠肺组织结构完整,肺泡壁均匀、清晰;染矽尘组大鼠可见肺组织结构出现不同程度的破坏,并出现典型的矽结节的改变,矽结节以细胞成分为主,其内胶原纤维增加;肺间质纤维组织增生;肺组织出现严重的病理学改变。结论1本实验发现大鼠染矽尘后BALF中的细胞成分包括白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞从数量上出现明显的升高（P<0.05）,炎症细胞数量的增加,提示矽尘进入肺组织后诱导出现了严重的炎症反应,造成了肺组织的损伤。2本实验通过对正常及染矽尘大鼠BALF中的蛋白含量、SOD活力、微量元素（铁、锌、锰）含量的测定发现在肺组织出现损伤及其损伤修复的过程中这些物质都发生了明显的变化（P <0.05）,通过对其作用机制的分析,可以为最终阐明尘肺的发病机制起到一定的参考作用。3本实验发现大鼠染矽尘后BALF中的CC10表达减少（P <0.05）,检测CC10可反映早期Clara细胞的损伤情况,从而获悉一些肺组织病变发生及发展变化的情况,BALF中CC10含量的变化可以作为肺损伤出现及其恢复的标志物之一。4通过运用蛋白质组研究的双向电泳技术,对两组动物BALF中的可溶性蛋白成分进行了分离,获得了清晰的正常及矽肺大鼠BALF中蛋白质的双向电泳图谱,两组大鼠BALF2-DE图谱的差异揭示了相对于正常组,染矽尘组BALF中蛋白成分产生了质和量的改变。

论文目录

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• 前言
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• 结果
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• 结论
• 参考文献
• 综述 染尘大鼠支气管肺泡灌洗液成分分析
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